近日见了15版药典的意见征询稿,无菌项检查大改,抓紧整理与自家相关的东西。
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1.改良马丁培养基改为胰酪大豆胨液体培养基(TSB)
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10版:硫乙醇酸盐流体培养基主要用于细菌培养,改良马丁培养基适用于真菌培养。
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15版:硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌培养,TSB适用于真菌和需气菌培养。
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专家们终于知道培养需气菌是TSB比硫乙醇酸盐流体培养基管用了,就我感觉改良马丁培养基都比硫乙醇酸盐流体培养基管用,只是这么明改太坍台了,干脆扯个TSB出来——人家是国外进口的,欧典美典的要求吧。
不过根据经验,TSB养起真菌来未必有改良马丁培养基管用,毕竟含糖量少。白色念珠菌在TSB里就不如改良马丁培养基生长迅速(众专家怒:真菌又不是只有白念一种!)。
8 \: u# T; H% d. X/ q/ t: p随着TSB“功能设定”的登场,再看看灵敏度检查与方法学验证(又称方法适用性试验)修改如何。二、三部药典无菌附录已合并。
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灵敏度检查
10版:硫乙醇酸盐流体培养基(金黄色葡萄球菌/铜绿假单胞菌/枯草芽孢杆菌/生孢梭菌)30-35℃,改良马丁培养基(白色念珠菌/黑曲霉菌)23-28/20-25℃。
15版:硫乙醇酸盐流体培养基(金黄色葡萄球菌/铜绿假单胞菌/生孢梭菌)30-35℃,TSB(枯草芽孢杆菌/白色念珠菌/黑曲霉菌)20-25℃。
方法学验证:15版:以上,改铜绿假单胞菌为大肠埃希菌。
& q* }# ~" C' a4 Q* O质疑ing~~
培养温度统一了二、三部药典,只是为啥跟随10版三部药典的脚步呢?我这边大部分无菌检查样品是二部的。
这硫乙醇酸盐流体培养基真心是“主要用于”厌氧菌培养基的吗?我怎么觉得“30-35℃”培养细菌是它的主要功能呢!
这TSB真心是“适用于”需气菌的吗?他们也就只敢丢个不挑剔温度的枯草过来做灵敏度,你要是丢个金葡铜绿过来,我看20℃它们长不长!
& e" n: N3 f+ k( k+ d2 S现下用于药品无菌的两培养基批批灵敏度检查了,枯草白念黑曲在TSB那儿又经历过多次无菌灌装验证用培养基的折腾,所以对于灵敏度检查来说,依然都是浮云。
但方法学验证就不是浮云了,所谓“方法学”,还得沿袭着看下去,这检验量或许也有更改呢。
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话说三部药典的无菌方法学验证菌种是这样子进化的:
05版三部(≠任何二部):乙型溶血性链球菌、短小芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌
10版三部(=05版二部):金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌
15版三部(=10/15版二部):金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌
——我就说10版三部跟随05版二部,却不跟随10版二部,是个天大的笑话。
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2.菌液扩增培养基的修改
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营养肉汤(NB)改为TSB,用于扩增金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌。
改良马丁培养基改为沙氏葡萄糖液体培养基(SDB),用于扩增白色念珠菌。
改良马丁琼脂改为沙氏葡萄糖琼脂(SDA),用于生产黑曲霉菌的孢子。
' P+ C, o6 _8 x$ S6 S# @: R这怎么看怎么别扭,TSB只需要检测枯白黑的灵敏度,却在这儿带着“我用于扩增细菌”的招牌,养起金铜大枯。混乱中。
* f5 p# m1 }9 J+ P6 E9 {/ ^8 t可为什么抛弃NB了呢?难道不能不指定扩增培养基,或加个推荐性的“如”字?让检测人员自行选择不成么?——有些菌我是倾向于用NB扩增的,不含糖,菌液均匀稳定,稀释梯度易估算;那TSB会使某些菌(比如铜绿最明显)爆发生长。再说NB是不会被逐出微生物实验室的,菌种保藏得用NB,TSB的糖会坏事。
- N) Y0 j6 [) y+ ^4 s, S生孢梭菌忠贞不渝地选择硫乙醇酸盐流体培养基,只是计数方法,药典依然没有明示。
. t1 W$ L2 y" H# \. C9 D) x# B- `8 l白念黑曲用沙氏葡萄糖系列我倒可以理解,这培养基增真菌的速度不亚于改良马丁培养基,看来后者是要被淘汰了。
c% Y1 `7 N# [3 K; n, z! c3.稀释液冲洗液种类的增加
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高兴地说,生理盐水终于被15版药典认可,能够光明正大被推荐作为稀释冲洗液了,这是借了三部药典合并的光环吧。
) h; j4 |- k" P( ]% M2 Z: @4.生物制品无菌检查依然两份的硫乙醇酸盐流体培养基
, Y9 ^. s3 J6 J) k一般样品:1份硫乙醇酸盐流体培养基30-35℃+1份TSB20-25℃
生物制品:1份硫乙醇酸盐流体培养基30-35℃+1份硫乙醇酸盐流体培养基20-25℃+1份TSB20-25℃
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555,还是不改啊,这可牵涉到方法学验证,那儿说“置规定温度培养3-5天”,这“规定温度”到底是指灵敏度检查中指定各菌生长的“规定温度”?还是无菌检查中指定各份滤器培养的“规定温度”?
; v& z- w2 V* ~0 `/ j a话说真要是测试“样品+硫乙醇酸盐流体培养基”的金黄色葡萄球菌/铜绿假单胞菌/生孢梭菌20-25℃,长不了的吧。
另好事哪个厌氧微生物非要20-25℃的硫乙醇酸盐流体培养基才能长出来……
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5.阳性对照的具体操作
; O+ K) U& N; W& o15版:“……无抑菌作用的供试品,以金黄色葡萄球菌为对照菌;……供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48-72小时应生长良好。”
7 W8 N6 x. a& ^就这么多,既不明说多出来的那一份阳性对照该是用(跟随金葡菌灵敏度的)硫乙醇酸盐流体培养基,也未明示阳性对照管该放置于(跟随金葡菌灵敏度的)30-35℃培养。更不说这阳性对照操作是无菌当日,还是允许14天后进行。——你们这算是药典的艺术么?
, ?4 N4 n, s% f还有,生物制品若失去了“可14天后接种阳性对照”的特权,无菌当日,一次四个集菌培养器?有卖不?还是用两组两联体?
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嗯,有一种最坏的理解:你这不是金葡么,你这不是两份跟随金葡的硫乙醇酸盐流体培养基么?你金葡的阳性对照做两组两个温度!!!——我保证第一个喊冤的不是我,“每份培养基接种的 样·品·量”绝对会让领导们心痛的~~
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6.上市抽验样品的最少检验数量
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表1《出厂产品最少检验数量》核对过了,未修改。上市抽验是表2,我们这儿适用于进厂物品的无菌抽样量计算。涉及到无菌包材和甘露醇。
500ml规格的液体制剂从6个改成了10个,开的甘露醇瓶数更多了。
, x4 c. a' V1 ~4 {1 ?& `1 p“医疗器具”10版的表2是没有的,我一直按着《GB-T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分 生物学试验方法》的规定鬼混。这下15版明确了,医疗器具 供试品最少检验数量是10,若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基,那么表中的最少检验数量加倍。——就是说注射器/胶塞/助力器/无菌针/无菌袋这些结合表3“每支供试品接入每种培养基的最少量是 整·个·器·具”,一次无菌检验量是直接接种法的10+10+1=21了喽。
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7.供试品的最少检验量
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最天雷的表3来了,什么培养基种类,什么菌种归属,这个表一出,成本刷的就窜上去了。
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就看与我们产品相关的几列。
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供试品装量V≤1ml,全量。——这条没有争议。直接接种法41支,薄膜过滤法60支,生物制品这规格范围的我们没有。
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10版(二部)
1<V<5, 半量
5≤V<20, 2ml
20≤V<50,5ml
$ y' f2 X6 y M10版(三部)
1<V≤5, 半量
5<V<20, 2ml
20≤V<50,10ml
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15版
1<V≤40,半量,但不得少于1ml
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这是神坑啊,以10ml装量举例,20支最少检验数量已定,按着10版,这10ml最多可以供给5份培养基(每份培养基索取2ml),就算要使3份集菌器+2份阳性对照也够了;到了15版,10ml只够给两份培养基,非生物制品,抽30支,生物制品,抽40支。
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哦,易溶的样品做时倒无所谓,40个,无非是时间长点罢了。若是大规格的凝胶呢?稀释液体积成倍翻上去,我给算算:
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20ml凝胶,6mg/ml,需稀释到1mg/ml过滤,30瓶*20ml*6体积稀释液÷3集菌器=1200ml——一张膜不是只允许过滤1000ml的么?死路中。
& W3 Z8 A3 Q! ^% y5 V* ]# u5 o要不继续直接接种法?翻去看,忽然觉察了15版这么改的阴谋!
2 c6 `: `2 j: P ^直接接种同理要求半量,又有接种样品体积最多为培养基体积10%的规定,那么20ml规格,直接接种的每种培养基是:20瓶*10ml半量*10倍=2000ml,要配好多培养基呀,于是大家都会倾向于薄膜过滤了是不?那才100ml滤筒。
~: }3 o \0 A! [9 v8 X, ^7 Z, W我服了你们成不?
我用酶去,哼!
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窃以为这个规定不一定行得通,我这儿的产品只是黏稠难滤需要稀释而已,其他药品呢?那些抑菌作用强的,好不容易驯化了一个合适的中和剂,你这一规定,样品量加上去,中和剂也跟着加,这方法适用性试验可有的头疼了。
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等最终版的定稿。
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8.改版定稿后需做的事情
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(1)把无菌灌装验证用TSB尽量与无菌检查用TSB归在一个批号,方便管理。
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(2)现在开始如果要买改良马丁培养基,切记不可买多了。
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(3)灵敏度检查重做。
$ U8 ^3 G( V. _& [- k% x# }. [0 q# w(4)Z产品2ml、2.5ml、3ml,E成品5万(=10ml)、其他效价(如果有的话),E半成品,E稀释液10ml、其他体积(如果有的话),Y原料药,N产品眼科,以上这些,方法适用性试验重做。也别省略什么菌了,我可不想去个药检所提供的报告是补充版的补充版,全体过一遍。
9 O9 B. W3 m3 |. z% t% t至于N产品的外科,方法学肯定也同上一起做了。可到底是直接接种法还是薄膜过滤法呢?前者的接种量会让培养基泛滥,后者的接种量必定要用酶,等着15版定稿再说。纠结的大规格,万一哪日它大到100ml去了怎办……
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2014.5.13