一致性评价-粒度分析方法开发和验证

汤晨懿 汇聚南药

背景介绍一致性评价和仿制药开发过程中,粒度是API、辅料和制剂中间体的粉体学研究重要技术指标之一,传统的粒度测量方法中,以过筛最为常见,常以“目”为单位。粒度与目数有个快捷换算方法,二者近似乘积为15000。过筛的方法虽然成本低,但是难以给出具体的粒度分布情况,人为因素影响较大,且“目”的概念相对比较含糊,不同的标准如美国标准、英国标准及泰勒标准还是有细微的差别,这样对沟通操作可能带来一些不便。
随着时代的进步,多种新型的测量仪器的应用也使得对粒度的把握更加准确,如激光衍射粒度分析仪、库尔特计数仪、颗粒图像处理仪器及离心沉降仪等等。不同设备的测量原理不同,导致结果会有所差异。例如沉降仪所依据的理论是Stokes公式中球形颗粒的沉降速率与粒径之间的关系,而对不规则颗粒,二者之间的关系是未知的,为此沉降仪所测得的粒径相当于某一球体的大小,称之为沉降速度粒径;库尔特计数器得到的称之为等效电阻粒径;激光粒度仪给出的粒径称之为等效散射光粒径。因此,只有颗粒为完整的球形时,所有设备测得结果才有可能是相同的。
随着当前对药品质量的要求越来越高,口服固体API和辅料的粒度分布影响着药物的溶出速率甚至是体内吸收,无论是制粒或者粉末直压工艺都需要对粉体颗粒的粒度分布有一个严格控制范围,粒度分布直接影响颗粒的流动性、可压性甚至含量均匀度等等。本文将对激光衍射粒度仪测量方法的开发进行一个简单的介绍。

激光衍射法精密度、准确度执行标准简单的说,激光衍射粒度仪主要是利用了光的散射原理测量粒径,是基于颗粒体积的计算技术,将不规则颗粒假设为等体积球模型。颗粒的粒度越小,散射角越大。

                               
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图片来源:EP8.0-2.9.31Particle size analysis by laser light diffraction

2010版和2015版<中国药典>粒度和粒度分布测定法均收录了第三法(光散射法),制剂通则仅对仪器的一般要求和测定法进行了简单介绍,目前CFDA尚无应用第三法进行API粒度分析方法开发和验证的相关指导原则。USP的?429?LIGHT DIFFRACTION MEASUREMENT OF PARTICLE SIZE和EP的2.9.31. PARTICLE SIZE ANALYSISBYLASER LIGHT DIFFRACTION均是基于ISO标准13320-1(1999)和9276-1(1998)开发的,国内有相应的中文版GB/T 19077粒度分析-激光衍射法和GB/T 15445粒度分析结果的表述。ISO 13320现行版本已经更新到2009年版了,而最新版的USP和EP还在沿用1999年版。现行版本ISO 13320:2009 IDT最大的改变就是增加了一些为准确测量而提出的试验方法与过程。下面我们来看下仪器校验精密度和准确度的主要差别。

标准		USP	EP	CP	ISO 2009
精 密 度	标准粒子	样品	样品	粒子最大粒径与最小粒径比约10:1	x90/x10=1.5-10
	测量次数	6	6	5	5
	D(0.5)	RSD <10%	RSD <10%	RSD <3%	RSD <3%
	D(0.1) D(0.9)	RSD <15%	RSD <15%	RSD <5%	RSD <5%
	粒径小于10μm	RSD翻倍	RSD翻倍	RSD翻倍	RSD翻倍
准 确 度	标准粒子	样品	样品	粒子最大粒径与最小粒径比约10:1	x90/x10=1.5-10
	测量次数	3	3	5	3
	D(0.5)	RSD<10%	RSD <10%	RSD <3%	RSD <3%
	D(0.1) D(0.9)	RSD <15%	RSD <15%	RSD <5%	RSD <5%
	RSD翻倍	RSD翻倍	RSD翻倍	RSD翻倍	RSD翻倍

对比各指导原则,我们在实际应用时可采用更为严格CP或ISO2009对仪器的紧密度和准确度进行校验。通常在实际研发过程中,API或者粉末固体的粒度分布是控制在某一特定范围内,因此开发粉体测量方法时,选择USP或者EP作为一个接受标准。


粒度分析方法的开发-干法稳定性对于一个测量方法的重要性不言而喻,而影响干法和湿法的影响因素各有不同。无论是使用干法或者湿法,取样的代表性直接影响着测量结果。个人觉得取样方法可参考混合均匀度的取样方式(BU混合/CU含量均匀度该怎么取样,判断合格?)。若样品均适合干法或者湿法测量,原则上结果应该是相似的。
对于干法而言,分散介质一般为空气,则首先需要考虑高压分散气体的洁净度、含水量等。接下来就是我们在开发方法中需要考察的参数:分散压力、进料频率等。当然如需非常精确的测定,还需要知道该物质的折射率,可以查阅文献、ISO13320及使用常规的光学仪器如阿贝折射仪等测量。若对精度没有特别高的要求,一般可选仪器默认值。
分散气压:决定样品的分散程度,也是干法测量中一个关键参数。分散气压过小,样品没有充分分散,测定数据偏大;分散气压过大,可能造成对样品的破坏(气流粉碎效应)。以某粉末的粒度测试结果为例,平行测量3次结果见下图:结合可接受标准,即可选300Kpa(平台)作为分散气压,大于350Kpa出现气流粉碎效应。

                               
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进料频率:需根据粉体颗粒的流动性来调节,在分散气压确定的情况下,可结合遮光率的结果来反馈,遮光率太高在系统内可能发生重复散射现象,太低则噪音信号会淹没样品信号。一般情况下,细分遮光率0.5~3%,粗粉可放宽到0.5~6%。
这里以另一粉末的粒度测试结果为例,分别考察30%、40%、50%、60%进样速率,平行测量3次结果见下图:结合可接受标准,遮光度均符合要求,各测量组无统计学差异,因此选择RSD最小的50%作为进样速率。

                               
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中间精密度:在确定好分散气压和进料频率后,需要对方法的重现性或者说考察一下方法的中间精密度,通常是两名操作人员对既定方法分别进行6次测定,计算12次测量结果的RSD。若RSD在可接受标准范围内,既可以将该方法确定为干法测量的SOP。



粒度分析方法的开发-湿法相比干法,湿法在分散这一步骤需要考虑的因素相对较多,湿法相比干法多了分散介质的折射率,可通过溶剂的供应商或者相关的文献查询。湿法是一个循环连续的测定过程,样品的加入量一般是随着颗粒粒径的增大而增大,也可通过遮光比这一参数控制。通常,对于非常细粉,遮光率<5%,细粉5~10%,粗粉10~15%,多分散体系15~20%。另外如分散介质的选择,分散方式的考察将是方法开发的主要考察内容。对于分散介质要求无杂质,光学性质均衡不与样品发生物理、化学变化良好的润湿作用良好的溶剂,这样才能使得分散体系均匀、易于进样。一般常用的介质为去离子水、乙醇、异丙醇等。
超声时间:对于细粉,由于表明张力或者静电等原因会在分散介质中发生二次团聚现象,这时就需要通过超声、加入表面活性活性剂或者稳定剂等方式改善分散体系,需注意的是在分散过程中避免气泡的产生。超声的时间一般与颗粒大小有关,随着颗粒增大而时间延长。表活的加入主要是为了增加润湿性,实验室常用的吐温、SDS等均可使用,一般浓度为千分之五。另外也可以适当加入一些稳定剂如六偏磷酸钠、焦磷酸钠等,增加颗粒的Zeta电位。
对于是否分散均匀,直观可以通过显微镜观察。同时也可以实测粒径数据变化获得。处理方式为超声,结果如下图:结果表明随着超声时间的延长,最终粒径的变化趋于平缓且RSD满足标准,表明测得结果可接受。

                               
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搅拌转速:对于样品池中搅拌速度的考察,同理也是结合粒度的变化及RSD的范围,需要注意的是筛选一个适宜的转速将大颗粒悬浮起来。如图,可选择2500rpm为分散速率。

                               
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小结无论干法或者湿法,二者都是对影响分散状态的参数进行考察,不同的是干法重点考察分散气压,而湿法则需考虑分散介质和分散方式。我们也需根据粉末或者颗粒的性质选择适宜的测量方法。


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