透皮吸收试验经验汇总

对透皮吸收文献及相关指导原则的学习（一）
备注：本人最近在做软膏，故做了些相关工作，拿出来分享下，希望对大家有帮助，纯属个人理解！
根据《非无菌半固体制剂扩大规模和上市后变更：体外释放试验和体内生物等效性要求》的内容，第15页Ⅶ.体外释放试验，释放与时间的平方根呈比例。
以单位面积释放的药物量（μg/cm2）相对时间的平方根进行线性回归，其斜率即为释放率/透过率。
释放率/透过率具有剂型特异性，可被用于监测产品质量。
扩散池系统：
带有标准开帽式毛玻璃样表面的扩散池系统，注入孔直径为15 mm，整个系统直径为25 mm。Franz扩散池。
人工膜：
适当的惰性和商业化的人工膜，如：聚砜，醋酸纤维素/尼龙混合酯，或聚四氟乙烯70μm膜。大小适合扩散池直径（即上文提到的25 mm）。有文献提出用猪皮及大鼠皮肤。
接受液介质：
适宜的接受液介质，如水性缓冲液用于水溶性药物使用，或者含水醇介质用于水溶性较差的药物，或其它经过适当调整的介质，如生理盐水。
样本量：
多次重复（建议6个样本）测定皮肤局部用药的释放率（特征）。
样本使用：
将大约300 mg半固体制剂均匀置于人工合成膜上，保持封闭状态防止溶液蒸发和成份改变。这对应于没有剂量限定的情况。
采样时间：
建议在一个适当的时期内多次采样（至少5次），以便产生足量释放的特征和确定药物的释放率（在为期6个小时的研究期间内，采样次数不少于5次，即采样时间为30 分钟、1、2、4和6小时）。不同制剂的采样时间可能不同。在每个采样点取样后补充新鲜的接受相液体，以便在整个实验过程中人工膜的下表面始终保持与接受相的接触。
样本分析：
应该采用经过适当验证的特异的且灵敏的分析方法分析样本，以确定药物浓度和药物释放量。
体外释放率：
用单位面积释放的药物量（mcg/cm2）相对时间平方根绘图应生成一条直线。直线的斜率（回归）代表制剂的释放率。对应于1小时部分的X轴的截距是此类曲线在正常状态下的特性。


对于局部应用局部起效的半固体制剂，我建议把他分为两部分：体外释放和体内的局部分布。
体外释放用半透膜模拟皮肤，方法就是你一楼所说的。这个实际上类似固体口服制剂的溶出度。
体内分布采用活体，给药后不同时间取皮肤，分层测定药物含量。取几个关键时间点就可以了，不需要像药代那样做那么多点。如果你这个药品外用后入血少的话，好好设计一下实验，一两头小香猪应该就可以搞定了。
对于你现在做的以香猪皮为皮肤模型采用franz扩散池来进行透皮研究，个人认为意义不大，毕竟透过皮肤的药物实际上就是入血的部分，不是局部起效的部分。扩散实验结束后再测定皮肤内药物含量，当然也能部分说明问题，但总不如用活体做分布。
皮肤分层我们当时也做得很不成功，建议你咨询一下周边的科研院校，必要的时候也可以委托一下。角质的分离比较容易，胶带即可，但表皮和真皮的分离我们也没有做得很好。实在不行，就测定整个皮肤的含量吧。
实验结束后，残留药物可以将药膏清洗下来进行测定。必须彻底将残留药物清洗干净，否则会影响皮肤内含量的测定。




释放率（特征）比较研究的设计
典型的体外释放测试设备有6个扩散池。对于测试设备的每次运行，应该将比较研究所用的2种制剂按以下分配：
或者
此处，T代表变更后批次（受试制剂），R代表变更前批次（参比制剂）。采用这种每次运行中包括2种制剂的体外释放的方法，有助于消除运行之间存在系统差异，确保无偏差的比较。
体外释放比较试验的详情
体外释放比较应该分两步进行。
第一步，体外释放设备（6个扩散池）应该运行2次，变更前批次（R）和变更后批次（T）各产生6个斜率（估计的体外释放率）。应该计算变更后批次的中位体外释放率（总体中的）与变更前批次的中位体外释放率（总体中的）比值的90%置信区间（见以下描述），用百分比表示。在第一阶段，如果90%置信区间在75% ~133.33%的限度范围内，则不需要做进一步的体外测试。
如果第一阶段的测试不合格，则应该增加4次体外设备（6个扩散池）的运行，变更前和变更后批次各增加12个斜率，或共18个斜率（包括第一阶段的结果）。每个产品共采用18个斜率（包括第一阶段的测试结果）计算制剂的总共的90%置信区间（见下文）。在第二阶段，上述90%置信区间应该在75% ~ 133.33%的限度之内。
置信区间的计算——1个实例：
由于预计此次测试时会出现极端值（例如，由于制剂样本和人工膜之间存在气泡），所以建议使用易于抵抗极端值出现的非参数方法。在以下实例中描述了计算方法。
假设第一阶段获取的斜率数据如下：

变更后批次 (T)	变更前批次 (R)
1.3390	1.1331
1.3496	1.1842
1.4946	1.0824
1.4668	1.3049
1.1911	1.0410
1.2210	1.2419

置信区间计算的第一步是产生36个（= 6 x 6）单独的T/R比值。在下列表格中给出了各T/R比值，变更前批次的斜率（R）列在表格上部，变更后批次的斜率（T）列在表格左边缘，表格的主体部分给出了各个T/R比值的数据。

RT	1.1331	1.1842	1.0824	1.3049	1.0410	1.2419
1.3390	1.1817	1.1307	1.2371	1.0261	1.2863	1.0782
1.3496	1.1911	1.1397	1.2469	1.0343	1.2964	1.0867
1.4946	1.3190	1.2621	1.3808	1.1454	1.4357	1.2035
1.4668	1.2945	1.2386	1.3551	1.1241	1.4090	1.1811
1. 1911	1.0512	1.0058	1.1004	0.9128	1.1442	0.9591
1.2210	1.0776	1.0311	1.1280	0.9357	1.1729	0.9832

置信区间计算的第二步是将上述36个T/R比值从低至高进行排序。
0.9128、0.9357、0.9591、0.9832、1.0058、1.0261、1.0311、1.0343 . . . 1.2863、 1.2945、1.2964、1.3190、1.3551、1.3808、1.4090、1.4357。
第三步，上文中排序的第8个和第29个比值分别是T的中位体外释放率（斜率）与R的中位体外释放率比值的90%置信区间的下限和上限。本实例中，90%置信区间为1.0343~1.2863，或用百分数表示为103.43%~128.63%。
由于90%置信区间在75%~133.33%范围内，所以本制剂通过了第一阶段测试。
如果第一阶段的测试不合格，则应该增加4次体外设备（6个扩散池）的运行，变更前和变更后批次各增加12个斜率，或者共18个斜率（包括第一阶段的结果）。
应获得全部324个T/R比值（=18x18），并从低至高进行排序。显然，即使不厌其烦地手动计算了第一阶段的数值，但第二阶段的数值无法进行手动计算。应使用计算机。
第二阶段，位于第110位和第215位的比值分别是T的中位体外释放率（斜率）与R的中位体外释放比率比值的90%置信区间的下限和上限。如果90%置信区间在75% ~133.33%范围内，则本制剂通过了第二阶段测试。
上文描述的统计方法没有考虑测试的程序块结构（即1次获取6个斜率运行数据，而不是一次获得全部数据的事实）。通过以下进行判定：
1．在提供药品审评中心的体外释放数据中没有证据表明重要的批次间效应。
2. 所建议的每次运行包括2个产品的实验设计将有助于在出现批次间效应的情况下确保没有偏向性。
文献的学习：
舒城仁的《复方利多卡因乳膏体外透皮吸收试验》，使用的大鼠皮肤，吸收液用的是pH7.4的磷酸盐缓冲液，转速300pmr，上样量1.0g。分析结果用平均累积释放量对时间t进行线性回归，方差分析不同批次间各点的累积释放量。
汪宏等的《他克莫司软膏的体外透皮吸收研究》，使用巴马香猪腹部皮肤，接收液用的是30%乙醇磷酸盐缓冲液（1.36g的磷酸二氢钾，79ml的0.1mol/L的氢氧化钠溶液，加水稀释至200ml，即得pH7.4的磷酸盐缓冲液，取140ml该溶液，加入60ml无水乙醇，混匀，即得）。上样量0.5g，转速180pmr。皮内滞留药物测定采用的是将除干净软膏的猪皮剪碎，乳钵研磨后，加接收液超声30min提取，离心，取上清液作为样品。其分析结果方法同上。接收液选择前要做漏槽条件，确定合适溶解度。
肖学成等的《HPLC测定他克莫司软膏体外透皮吸收》，使用巴马香猪腹部皮肤，接收液用的是生理盐水-无水乙醇（1:1）。上样量0.5g，转速300pmr。未做皮内滞留药物测定。其分析结果方法同上。接收液选择前要做漏槽条件，确定合适溶解度。
优点：
一，给出明确的透皮吸收的单位面积累积渗透量（Q）计算公式：
Qn=V0×qn/V+
式中V0为接收液总体积，V为取样量，qn为第n次实测单位面积渗透量qn=样品峰面积×对照品浓度×接收液取样量/(对照品峰面积×释放面积)，qi为第n次前各时间点每次测得的单位面积渗透量。
二，样品溶液稳定性将12h接收液于室温下存放24h，分别于0，4，6，8，12，24 h量取20μL注入液相色谱仪，计算峰面积的RSD。
有文献《接收液中的乙醇浓度对药物体外透皮试验的影响》指出，接收液中无水乙醇的体积百分比不应大于20%，否则皮肤性状改变，进而引起透皮吸收速率的变化。

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