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一、含量方法学研究所需图谱(流动相、检测限和定量限参照有关物质,如有关物质和含量方法一致,可以只做进样精密度、溶液稳定性). }: F& ~% j W, s0 n0 S
1、线性:包含60%、80%、100%、120%、140%,通常是5~7针,要求r.0.999。
4 I) L2 V2 I2 x" i2、进样精密度:用对照品做,单样连续进六针,要求RSD<2.0%。
3 R- D) U$ A6 F. J3、重复性试验:双样双针,一个样进两针,六个样,两个对照,总共16针,要求RSD<2.0%。1 u1 {2 U0 h0 C6 ~: D
4、回收率(准确度):总共22针,分别做三个80%、三个100%、三个120%,一个样两针,两个对照四针,九个样18针,要求回收含量在98%~102%之间,RSD<2.0%。# L5 v& L4 [; C% B
5、含量测定:总共28针,方法验证—两个对照品四针,仿制品两个样四针,小试样品两个样四针。中试样品三批—两个对照四针,一批双样四针,三批六个样十二针。
$ W: G7 E" B4 H0 h2 u6、溶液稳定性:单样单针,分别0h、1h、2h、4h、6h、8h,RSD<2.0%。7 q3 L+ P2 p0 k" n) p% v
7、专属性:空白辅料、空白溶剂、正常样、热破坏样、酸破坏样、酸液空白样、碱破坏样、碱液空白、光破坏样、氧化破坏样、双氧水空白样。共九针,需达到降解约20%,该杂质峰与其它峰应能完全分离,分离度不得小于2.0(已知杂质)。! p& D" \7 ?$ z" s7 s4 U% y
8、稳定性试验:包括加速0、1、2、3、6月30、40℃,长期3、6、9、12、24月,均做含量测定和有关物质。含量测定双样双针,一样两针,一批两样,三批六样十二针,两个对照四针。有关物质做空白7 b; k: ^* V: x9 |. M) E
溶剂,单样单针,100%样品、1%自身对照,共七针。
9 j) N1 l: w! E8 s/ F- c二、有关物质方法学研究所需图谱1 c; ?4 P2 |+ @5 H4 z
1、波长扫描和流动相的选择:参照国家标准并根据欧洲药典、USP英国药典以及日本药典中收载的流动相做,取样品,配成一定浓度进样,进行比较确定,选取其中最合适的。确定流动相后,并驱样品、对照品以及国外上市样品,配成参考文献中的浓度,进样;/ M& P0 g+ o0 ^ H# u$ Z
要求:分离度达1.5以上,分析时间通常为主身份保留时间的2-3倍,分析时间长可考虑采用梯度洗脱,共 n+3张图谱9 h# V! z. O ~
系统适用性试验:配制6份相同浓度的杂质溶液进行分析,该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%,保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另外,杂质峰的拖尾因子不得大于2.0,理论塔板数应符合质量标准的规定。(已知杂质)7 R1 m2 L+ J/ `( h5 D) I8 P& [
耐用性:分别考察流动相比例变化±5%、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、检测波长变化±5nm、流速相对值变化±20%以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时,仪器色谱行为的变化,每个条件下各测试两次。可接受的标准为:各杂质峰的拖尾因子不得大于2.0,杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离;各条件下的杂质含量数据(n=6)的相对标准差应不大于2.0%,杂质含量的绝对值在±0.1%以内。
9 }2 B8 c! J# A( a' _. A, j8 Z2、空白溶剂以及辅料干扰试验:取溶解样品用的溶剂,注入液相色谱仪,记录色谱图。观察溶剂图谱情况。并取样品、处方量的空白辅料按同样方法配成一定的浓度,进样,记录的谱图。看辅料是否有干$ r, X- P Y) M d. J( M
扰。共三张图谱,辅料吸收峰面积相对于主峰<0.05%视为无干扰。 杂质定位:如有已知杂质并且杂质对照品可获得的,配制杂质对照溶液,进样,记录色谱图。共四张图谱。
* G( Z! G/ v+ f" g5 T4 Y; d- H3、专属性:正常样、热破坏样、酸破坏样、酸液空白样、碱破坏样、碱液空白、光破坏样、氧化破坏样、双氧水空白样。共九针,需达到降解约20%,该杂质峰与其它峰应能完全分离,分离度不得小于2.0(已知杂质)。' h3 t' V% G4 b' w: A
4、检测限与定量限:检测限用稀释法—12个样12针。配制6份最低定量限浓度的溶液,所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%,峰面积的相对标准差应不大于5.0%。检测限S/N>3,定量限S/N>10。7 H. f* Q5 f& f# l( ^
5、回收率(已知杂质):分别做三个80%、三个100%、三个120%,一个样两针,两个对照四针,九个样18针,要求回收含量在80%~120%之间,RSD<2.0%。各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间,如杂质的浓度为定量限,则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%,相对标准差应不大于10%。 ^' c6 G1 c( v* k* W$ r
6、线性:包含60%、80%、100%、120%、140%,通常是5~7针,要求r>0.999。截距在100%响应值的25%以内,响应因子的相对标准差应不大于10%。
2 H4 j4 b1 O1 |! s: b4 J% i: Z# d9 F7、1%精密度:单样连续进六针,要求RSD<2.0%。- }/ b( f1 ?) c4 V7 v6 u& X
8、重复性试验(已知杂质):双样双针,一个样进两针,六个样,两个对照,总共16针,要求RSD<15.0%。
0 o2 z7 V+ n& V0 S# A, P' D9、溶液稳定性:单样单针,分别0h、1h、2h、4h、6h、8h,RSD<2.0%。按照分析方法分别配置对照品溶液与供试品溶液,平行测定两次主成分与杂质的含量,然后将上述溶液分别贮存在室温与冰箱冷藏室(4℃)中,在1、2、3、5和7天时分别平行测定两次主成分与杂质的含量。可接受的标准为:主成分的含量变化的绝对值应不大于2.0%,杂质含量的绝对值在±0.1%以内,并不得出现新的大于报告限度的杂质。8 J" o- d( T: m% D) R
10、小试方法验证及被仿制品:被仿制品1%自身对照,被仿制品100%样品,小试100%,小试1%自身对照。方法验证:中试样品三批,100%样品和1%自身对照,空白溶剂。
) }) z# a. I6 N2 C- S% U9 n# ]11、注明:主峰图谱要求——拖尾因子0.95≤r≤1.05,分离度最好要求1.5,理论板数一般不低于3000.(个别品种需根据实际要求而定)。. l8 O+ w' n; C6 T/ P
三、聚合物方法学研究图谱3 c J( U: y" q5 Z$ @
1系统适应性试验(水和磷酸盐缓冲液):蓝色葡聚糖2000和对照品,理论塔板数要求不低于700。
. b" j3 _1 z( c( n2、空白辅料
- f* |) O! i' \+ h' t3、供试品
/ W7 Y- O. g* [+ J% k( v5 ^4、专属性试验:供试品,辅料干扰。
$ P; z3 k6 f l: h8 v6 U5、检测限与定量限:般以信噪比3:1相应浓度确定最低检测限,以检测限×1000的量或浓度作为测定量(浓度)3 J1 ^5 R- `7 X6 ^) q6 A4 w' D9 Y
6、1%进样精密度:单样连续进六针,要求RSD<2.0%。
- f+ I4 Z. g0 f( D2 i7、溶液稳定性:单样单针,分别0h、1h、2h、4h、6h、8h,RSD<2.0%。
9 N: @3 P% }- B1 o4 q6 n; h8、线性:(浓度范围20%-200%)7个样。+ H) m* D, C; l1 D! Z7 J
供试品溶液的浓度与聚合物测定结果的相关性考察:制备系列的供试品溶液,浓度范围为规定浓度的50%~200%,共三份样品,以测得的高聚物峰面积对溶液浓度进行线性回归,相关系数r应大于0.99。 F值测定的重现性考察:F值为对照溶液的浓度(mg)与测得的峰面积的比值,要求日内、日间的相对标准偏差在5%以内。
) Q9 e+ `9 B: ~& u/ J对照品
. ^3 q' N' B/ l4 [20%
& b9 h* u; n! y# w6 C5 I50%
E, w2 C; V0 L* n t$ M9 V# g80%4 ]- p ~8 U: e) Z& x
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150%4 u' l; y l. f& N, E1 c0 n& V' |
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9、聚合物测定(方法验证)
; Z$ q1 X+ h8 u2 a5 z7 K( V8 ~4 A! t四、影响因素五天和十天:分别作含量测定和有关物质
7 I& G$ _) n* d( ^" W含量测定双样双针,一样两针,高温,高湿,强光、对照品。 有关物质单样单针,100%样品、1%自身对照,空白溶剂。
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