马上注册,结交更多好友,享用更多功能,让你轻松玩转社区
您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册 
x
不同缓冲液流动相配制方法对分析结果有什么影响?
) Z) C2 \* @8 r1 w8 x8 b答:HPLC的流动相主要用水性溶剂(水以及缓冲液)、有机溶剂、或它们的混合液。但不同资料上对缓冲液的表示方法不一,因此往往会对缓冲液有不同的解释,使得资料上表示的内容与实际配置的方法不同,而产生流动相的差异,影响色谱图和分析结果。而且,不仅是缓冲液,有时还要考虑到溶剂的混合方法等流动相配制方法等因素。下面以具体的事例,说明流动相配制方法对分析结果的影响。
6 `9 R: e/ H; d2 _0 \& V2 @
2 T. E& @' U! D |3 J0 n& V% `7 R+ g1 X
(1)缓冲液的配制
" ~7 D: A- {5 W/ z% u7 D“20mM磷酸缓冲液(pH2.5)”如何配制,由于表述的不清楚,有许多种可能的配法,就是以钠离子而言,“20mM”也不清楚是磷酸还是磷酸钠的浓度。若认为是“20mM”磷酸(钠)缓冲液,“20mM”可看作是磷酸的浓度。另一方面,若把“20mM”看作是钠的浓度,也可以认为是“20mM磷酸二氢钠水溶液调节pH后的缓冲液(而且,20mM磷酸钠水溶液的pH在5.0附近,只要稍用一点酸就可调到pH 2.5)。这时,由于调节pH用的酸,产生离子对的效果,会对分析结果有影响。
* @, s: Z' Q9 p w8 |, `9 @2 A# H) e
这三种不同的解释,在实际中对分析结果有很大的影响,见图3.6所示。A是“20mM”作为磷酸浓度解释,将作为“20mM磷酸(钠)缓冲液(pH2.5)”调节的溶液用于流动相的结果。B和C“20mM”作为磷酸二氢钠的浓度解释,分别加磷酸和高氯酸调节pH为2.5时的结果。可见,不同的缓冲液配制方法对二氢可待因的保留时间有明显的影响,这给分析造成一定的困难。因此,对缓冲液应尽量明确溶液的特性和配制方法(尤其pH的调节),以免产生不同的解释。
% \6 n0 P. Q0 v* ]% H( r- {4 X1 Q# g D) A2 t! a
) [; C. `) P @2 M- q2 ]! O(2)有机溶剂和水性溶剂的混合方法
3 m$ q5 k3 L( Z6 {- [: }* ^6 m有机溶剂和水性溶剂的混合液是经常作为流动相用的,但由于混合方法的不同,有时分析结果相差很大。如上例中,采用20 mM磷酸(钠)缓冲液(pH 2.5)与乙腈的混合液时,若混合比为9:1,即20 mM磷酸(钠)缓冲液(pH 2.5)与乙腈的体积比为9:1,也就是可以解释为各自按体积比量取后进行混合。另外,也可以理解为20 mM磷酸(钠)缓冲液(pH 2.5)中含有10%的乙腈。按两种理解方式配制的流动相会对分析结果(特别是保留时间)有显著的影响,这点必须注意。
( Y9 m/ a# x4 T g& u r& m6 t: z2 F
$ g# J* E2 R0 D6 l' @在一般的情况下, 配制HPLC用流动相时,用A液:B液=3:2(V:V)的表示方法,即A液体积比相当于3,B液体积比相当于2,分别量取混合(实际上混合后的溶液体积要小于5)。
: A/ k2 B. t4 [& m1 V/ M
2 {2 `7 K8 p) p
. m* b" ?& `5 i# _4 T2 Z: K(3)流动相缓冲液pH的调节$ C @6 `5 w6 x9 J( ?
流动相A:20 mM磷酸(钠)缓冲液(pH2.5)90%与乙腈10%混合,流动相B:20 mM磷酸(钠)缓冲液90%与10%乙腈混合,pH2.5。前者缓冲液的pH为2.5,但混合后pH会发生变化,后者含有机相混合液的pH为2.5,两者有明显的区别,分析结果也会不同。3 s5 O$ k" N5 C5 I/ J5 p; Y
6 I: s3 V2 v3 F2 E% R& i
3 d7 C, {' C- b, ~' W% b
在一般情况下,pH值仅指缓冲液的pH,不含有机相。总之,不仅是流动相的配制方法,试样溶液和其他溶液的配制也经常有上述问题。另外,在不同部门(医药部门或化工部门)各自都有自己的常识和习惯,在这种情况下,参考相关的标准和规范,以避免混乱。
7 O/ `" Y1 p" C7 H9 L) I/ w
; i. T B" G7 X. f3 Q8 N# W9 f 6 Q+ ~' ]! N& ]4 N4 H3 y% Q# s O
|