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下述是一个肝素钠的电泳法检测含量的方法,因译者没有接触过这种试验,希望各位对译文中不专业或错误的地方提出意见和建议,万分感谢!!!
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取琼脂4g,加水200ml,置沸水水浴中加热使溶胀完全后,于45-50℃冷却后,倒入浅口容器中,厚度约10mm,精致,待凝结成薄层后,将玻璃板平放至薄层上。 制胶 取琼脂糖289mg,加醋酸钡缓冲液(取0.04M醋酸钡适量,用冰醋酸调pH至5.8) 48ml,混匀,置水浴中加热使溶胀完全后,于45-50℃冷却,将胶液涂布于玻璃板(4.5 cm×7.5cm×1.5mm)上,厚度约1.5mm,静置,待凝胶结成无气泡的均匀薄层,即得。 电泳槽A 取琼脂糖NA 1.5g,加入醋酸钡缓冲液250ml,混匀,置水浴中加热使溶胀完全后,于45-50℃冷却,将胶液倒入电泳槽,厚度约15mm,于4℃静置过夜,待凝胶结成均匀薄层后,移走电泳槽中的电极及其中部槽架。 电泳槽B 取琼脂糖NA 1.5g,加入1,2-二氨基丙烷缓冲液(取0.05M 1,2-二氨基丙烷适量,用冰醋酸调pH至9.0)250ml,混匀,置水浴中加热使溶胀完全后,于45-50℃冷却,将胶液倒入电泳槽,厚度约15mm,于4℃静置过夜,待凝胶结成均匀薄层后,移走电泳槽中的电极及其中部槽架。 所得电泳室和玻璃板应于5±3℃中保存,并于2日内使用。 溶液配制:分别取依诺肝素钠供试品和对照品适量,分别制成浓度为10mg/ml的溶液,并往溶液中加入甲酚红,作为供试品溶液和对照品溶液。 首次电泳: 在电泳槽A内加入醋酸钡缓冲液,在槽架加入石油醚,将凝胶板置于电泳槽架上,于凝胶板负极端分别点样2μl,立即接通电源,在电压100V条件下,电泳约25分钟,关闭电源。 二次电泳: 在电泳槽B内加入1,2-二氨基丙烷缓冲液缓冲液,在槽架加入石油醚,将凝胶板置于电泳槽架上,立即接通电源,在电压100V条件下,电泳约35分钟,关闭电源。 染色与脱色 取下凝胶板,浸入0.1%w/v 鲸蜡烷三甲基溴化铵水溶液至少3小时;升温至60℃,再浸泡1小时,暖气吹干,直至形成透明薄膜;再将凝胶板浸入0.1% w/v 甲苯胺南的乙醇溶液-水-冰醋酸(100:100:2,v/v/v),浸泡20分钟使其染色,再浸入乙醇-水-冰醋酸(100:100:2,v/v/v)溶液使脱色。 不同组分的斑点在蓝色琼脂糖凝胶上均呈现深紫色,自电泳开始其运行次序如下: 组分 Rf(比移值) 慢速移动肝素 0.10-0.15 快速移动肝素 0.60-0.65 硫酸皮肤素 0.75-0.80 含量测定:使用密度计对斑点面积进行定量测定,波长为600nm,衰退范围:0.250, 裂缝:0.2×10mm,扫描长度:45/50nm,从密度计读数可直接获得各待测组分的含量,当快速移动肝素对照品含量为规定限度±10%范围内,试验方有效。供试品含快速移动肝素应为72%-88%,硫酸皮肤素应为12%-28%和慢速移动肝素不得过4% * N- G7 Q, g; r6 v3 G: ~' n$ m
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