无菌药品生产企业核心区微生物污染调查与分析

无菌药品的微生物污染是影响药品生产质量和引发临床不良事件的主要因素之一。我国药品微生物污染的调査数据较少，但是，近年来发生的安徽华源生物药业“欣弗事件”和黑龙江完达山药业“刺五加事件”等与微生物污染相关的事件，已经对公众的身体健康造成严重危害和无法挽回的损失。我国无菌药品生产企业在微生物管理方面存在人员及技术手段缺乏，管理水平较低的状况。如何促进无菌药品生产企业建立微生物监测体系，提高生产过程的微生物控制管理水平和对异常检验结果的分析、判断、处理能力，提高对重大安全隐患的排查、预防，以及对问题产品的快速反应，已成为我国药品安全工作的重中之重。

本研究通过对13家药品生产企业实际生产环境中微生物的污染采样，采用传统生化反应鉴定技术和分子生物学鉴定技术等手段，探索建立适合于我国实际的药品生产企业环境微生物鉴定和分型技术，为无菌药品生产企业完善微生物监控体系提供参考，为药品监督管理部门提供有效的监管和调查手段。

1    实验方法

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1.1        环境微生物的收集

对上海地区13家无菌药品生产企业（包含无菌注射液、无菌粉针剂、无菌原料药、生物疫苗和血液制品等）的核心生产区（即动态A/B或A/C级）环境进行调查。本研究分别采用空气撞击法(使用企业的在线监测设备）、平板沉降法和接触平板法采集浮游微生物、沉降微生物和表面微生物(含设备和人员）。在企业正常生产时间内，以自主监控方式收集污染微生物，收集到的微生物经两次胰酪胨大豆琼脂平板（TSA)分离纯化，在36.0°C培养24h后备用。采集和分离过程均使用法国生物梅里埃公司生产的预制TSA平板。

1.2        环境微生物的鉴定

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根据前期对微生物鉴定方法的研究将收集的微生物菌株分别采用API鉴定系统（生物梅里埃）、全自动微生物鉴定仪VITEK2Compact(生物梅里埃）和MicroSEQID测序技术（LifeTechnologies)进行鉴定和分析。

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2    实验结果

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2.1        微生物污染统计

本次调查收集到13家无菌药品生产企业的环境微生物分离株共计265株，见表1。

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在13家药品生产企业中，有1家企业在所有区域均未收集到微生物污染（占全部调査企业数的7.7%)。另有3家企业的A级区域在监测时间内未收集到任何形式微生物的污染（占全部调查企业数的23.1%)。

B区和C区共收集浮游菌和沉降菌分别为27株（占全部分离菌株的10.2%)和57株（占全部分离菌株的21.5%)，而A区的浮游菌和沉降菌则下降为13株（占全部分离菌株的4.9%)和23株(占全部分离菌株的8.7%)。浮游微生物经过B区或C区的隔离和净化作用后污染显著下降。但对表面微生物而言，由B区和C区分离的31株（占全部分离菌株的11.7%)到A区分离到27株（占全部分离菌株的10.2%)的隔离净化效果并不明显。

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2.2        微生物鉴定结果及分布

全部265株微生物的鉴定统计结果见表2。其中，葡萄球菌属细菌占全部分离菌的52.7%，芽孢杆菌和微球菌分别占全部分离菌的11.7%和10.5%。

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在葡萄球菌属中分离率居前4位的分别是表皮葡萄球菌31.1%(42株）、沃氏葡萄球菌21.5%(29株）、科氏葡萄球菌14.1%(19株）和人葡萄球菌11.1%(15株），具体情况见表3。

                               
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2.3    制药企业微生物污染分析

2.3.1        A级区污染微生物结果分析

汇总所有药品生产企业A级区环境菌监控结果，共收集到63株微生物，占污染微生物总数的23.8%。其中，人葡萄球菌和唾液链球菌为人体携带的常见菌种，而沃氏葡萄球菌、藤黄微球菌和芽孢杆菌均为常见环境菌，见表4。在A级区的微生物污染物类型较多、较复杂，应引起重视。

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2.3.2        B级和C级区污染微生物结果分析

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B级和C级区共收集到115株微生物，占污染物总数的43.4%。环境微生物监控分离微生物仍以葡萄球菌属为主，合计68株（占B级和C级区总分离株的59.1%)。其中，表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌和沃氏葡萄球菌分别占B级和C级区总分离株的15.7%、9.6%和9.6%，见表4。

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2.3.3   表面污染微生物结果分析

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各药品生产企业采集到操作人员和设备表面微生物共87株，占全部污染菌总数的32.8%。污染微生物比例最高的分别为表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和藤黄微球菌，分别占人员表面微生物总数的26.4%,17.2%和17.2%,见表4。

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3      讨论

3.1        微生物污染源分析

无菌药品生产企业在生产车间核心区域监测到微生物污染物，说明药品无菌生产过程存在微生物污染的安全隐患。为避免人源性微生物污染带入药品生产车间，各国《药品生产质量管理规范》(GoodManufacturingPractice,GMP)均要求从事药品生产的人员必须经过培训，严格按照无菌操作进行更衣、清洁和消毒工作。但从本次调查的13家药品生产企业的环境微生物污染结果可以看出，细菌性微生物污染仍以人源性葡萄球菌属细菌为主。因此，我国药品生产企业仍需要不断加强人员的无菌操作意识，加强环境灭菌消毒的管理和监控。

从各区域微生物分离数量看，不同洁净级别区域之间的空气微生物污染程度由低洁净级别向高洁净级别递减，符合区域隔离和空气净化的规律，但表面微生物污染程度在各洁净级别之间的差异不大。究其原因，一方面可能是由于人员表面接触带来的交叉污染；另一方面则可能是由于消毒频次和消毒剂效力问题导致的残留污染。因此，应该重视不同洁净级别之间的表面微生物，特别是两个区域连接部分的隔离效果和消毒保障，以防止污染物轻易地从污染区流人高洁净级别区域。

3.2        制药企业微生物污染控制

根据我国2010版GMP规定，对人员手套和人员表面微生物在C级操作区虽然不做要求，但操作人员携带的微生物是药品生产车间内环境菌的主要来源之一。在本研究中发现，3号和13号企业的环境菌控制水平较低，尤其是人员和环境表面的大范围污染使得无菌洁净环境无法得到有效保障。建议企业严格控制人员更衣和清洁程序，规范进人核心无菌操作区域工作人员的无菌操作步骤，增加消毒灭菌频率并有计划地更换消毒剂。针对无菌药品的从业人员，尤其是质量管理人员和直接从事生产操作的人员应加强无菌生产和风险管理的理念，为药品的安全生产提供必要保障。

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3.3        制药企业风险分类管理

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根据无菌制药企业对日常无菌生产洁净环境的控制能力，可以将无菌药品生产企业分成三类：A类（污染风险水平较低），能严格控制无菌生产环境，严格执行无菌保障措施；B类（污染风险等级中等），一般情况下能控制无菌生产环境，能及时、有效地实施纠偏行动；C类（污染风险水平较高），较难控制无菌生产环境的洁净度，不能及时、有效地实施纠偏行动。监管部门在对不同企业的监督和管理上可以有所侧重：对A类企业可以降低检查频率，重视文件审查；B类企业以现场抽查为主，重点关注纠偏措施和实施效果，C类企业应重点监督整改，并增加抽样监控频次。

虽然对企业进行一次环境调查产生的数据结果会存在偶然性和不确定性，但仍能反映出企业在日常的环境监控和生产管理中存在的问题。根据本次调査分析的结果，企业1、4、6、7、8和10的环境控制效果较好，如能持续保持则该6个企业（占全部调查企业的46.2%)可划人A类；企业2、5、11和12环境控制情况在可接受范围，如能及时采取有效的预防和控制措施则该4个企业（占全部调査企业的30.8%)可划人B类；其他3家企业（占全部调查企业的23.1%)在本次调査中环境污染较严重，如不能采取有效的改进措施将会划人污染高风险的C类。当然，这种划分并不是绝对的和静止的，而是应该根据大量的日常监控进行动态调整，使企业的生产均处于有效的监督之下。

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3.4    展望

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我国新版GMP发布后，对无菌药品生产企业的生产环境提出了更严格的要求。进行微生物污染监控的重要目的之一就是为企业自身达到安全生产的必要要求，为药品监督管理部门提供有效的调查、监测和监管手段，应对药品微生物污染事件，并为划分风险级别提供依据。

在GMP审查或监督检查过程中应关注企业日常微生物监控措施和污染调查分析，强调监控和调查的常态化。建立企业微生物风险评估和环境自查体系，对C类企业敦促其改进生产条件，将风险预警前移至企业日常生产过程，逐步规范企业生产行为。对药品监管部门而言，药品生产企业微生物数据库的实时更新，可以快速锁定污染源，将被动应急转变为主动监控，有效地保障人民用药安

全。

本研究调査了上海13家无菌药品生产企业的核心生产环境微生物污染情况，统计了一定时段内一次微生物采样和监控结果。企业作为药品质量第一责任人，应定期分析微生物污染情况并进行风险评估，结合原材料供应和终产品检查，不断改进生产工艺，加强人员管理，完善质量体系。