【佚名原创】现实离15版药典有多远之一：无菌检查篇

【佚名原创】现实离15版药典有多远之一：无菌检查篇2014-10-11 [url=]蒲公英[/url]
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近日见了15版药典的意见征询稿，无菌项检查大改，抓紧整理与自家相关的东西。

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1.改良马丁培养基改为胰酪大豆胨液体培养基（TSB）

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10版：硫乙醇酸盐流体培养基主要用于细菌培养，改良马丁培养基适用于真菌培养。

15版：硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌培养，TSB适用于真菌和需气菌培养。

专家们终于知道培养需气菌是TSB比硫乙醇酸盐流体培养基管用了，就我感觉改良马丁培养基都比硫乙醇酸盐流体培养基管用，只是这么明改太坍台了，干脆扯个TSB出来——人家是国外进口的，欧典美典的要求吧。

不过根据经验，TSB养起真菌来未必有改良马丁培养基管用，毕竟含糖量少。白色念珠菌在TSB里就不如改良马丁培养基生长迅速（众专家怒：真菌又不是只有白念一种！）。

随着TSB“功能设定”的登场，再看看灵敏度检查与方法学验证（又称方法适用性试验）修改如何。二、三部药典无菌附录已合并。

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灵敏度检查

10版：硫乙醇酸盐流体培养基（金黄色葡萄球菌/铜绿假单胞菌/枯草芽孢杆菌/生孢梭菌）30-35℃，改良马丁培养基（白色念珠菌/黑曲霉菌）23-28/20-25℃。

15版：硫乙醇酸盐流体培养基（金黄色葡萄球菌/铜绿假单胞菌/生孢梭菌）30-35℃，TSB（枯草芽孢杆菌/白色念珠菌/黑曲霉菌）20-25℃。

方法学验证：15版：以上，改铜绿假单胞菌为大肠埃希菌。

质疑ing~~

培养温度统一了二、三部药典，只是为啥跟随10版三部药典的脚步呢？我这边大部分无菌检查样品是二部的。

这硫乙醇酸盐流体培养基真心是“主要用于”厌氧菌培养基的吗？我怎么觉得“30-35℃”培养细菌是它的主要功能呢！

这TSB真心是“适用于”需气菌的吗？他们也就只敢丢个不挑剔温度的枯草过来做灵敏度，你要是丢个金葡铜绿过来，我看20℃它们长不长！

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现下用于药品无菌的两培养基批批灵敏度检查了，枯草白念黑曲在TSB那儿又经历过多次无菌灌装验证用培养基的折腾，所以对于灵敏度检查来说，依然都是浮云。

但方法学验证就不是浮云了，所谓“方法学”，还得沿袭着看下去，这检验量或许也有更改呢。

话说三部药典的无菌方法学验证菌种是这样子进化的：

05版三部（≠任何二部）：乙型溶血性链球菌、短小芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌

10版三部（＝05版二部）：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌

15版三部（＝10/15版二部）：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌

——我就说10版三部跟随05版二部，却不跟随10版二部，是个天大的笑话。

2.菌液扩增培养基的修改

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营养肉汤（NB）改为TSB，用于扩增金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌。

改良马丁培养基改为沙氏葡萄糖液体培养基（SDB），用于扩增白色念珠菌。

改良马丁琼脂改为沙氏葡萄糖琼脂（SDA），用于生产黑曲霉菌的孢子。

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这怎么看怎么别扭，TSB只需要检测枯白黑的灵敏度，却在这儿带着“我用于扩增细菌”的招牌，养起金铜大枯。混乱中。

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可为什么抛弃NB了呢？难道不能不指定扩增培养基，或加个推荐性的“如”字？让检测人员自行选择不成么？——有些菌我是倾向于用NB扩增的，不含糖，菌液均匀稳定，稀释梯度易估算；那TSB会使某些菌（比如铜绿最明显）爆发生长。再说NB是不会被逐出微生物实验室的，菌种保藏得用NB，TSB的糖会坏事。

生孢梭菌忠贞不渝地选择硫乙醇酸盐流体培养基，只是计数方法，药典依然没有明示。

白念黑曲用沙氏葡萄糖系列我倒可以理解，这培养基增真菌的速度不亚于改良马丁培养基，看来后者是要被淘汰了。

3.稀释液冲洗液种类的增加

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高兴地说，生理盐水终于被15版药典认可，能够光明正大被推荐作为稀释冲洗液了，这是借了三部药典合并的光环吧。

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4.生物制品无菌检查依然两份的硫乙醇酸盐流体培养基

一般样品：1份硫乙醇酸盐流体培养基30-35℃+1份TSB20-25℃

生物制品：1份硫乙醇酸盐流体培养基30-35℃+1份硫乙醇酸盐流体培养基20-25℃+1份TSB20-25℃

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555，还是不改啊，这可牵涉到方法学验证，那儿说“置规定温度培养3-5天”，这“规定温度”到底是指灵敏度检查中指定各菌生长的“规定温度”？还是无菌检查中指定各份滤器培养的“规定温度”？

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话说真要是测试“样品+硫乙醇酸盐流体培养基”的金黄色葡萄球菌/铜绿假单胞菌/生孢梭菌20-25℃，长不了的吧。

另好事哪个厌氧微生物非要20-25℃的硫乙醇酸盐流体培养基才能长出来……

5.阳性对照的具体操作

15版：“……无抑菌作用的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；……供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48-72小时应生长良好。”

就这么多，既不明说多出来的那一份阳性对照该是用（跟随金葡菌灵敏度的）硫乙醇酸盐流体培养基，也未明示阳性对照管该放置于（跟随金葡菌灵敏度的）30-35℃培养。更不说这阳性对照操作是无菌当日，还是允许14天后进行。——你们这算是药典的艺术么？

还有，生物制品若失去了“可14天后接种阳性对照”的特权，无菌当日，一次四个集菌培养器？有卖不？还是用两组两联体？

嗯，有一种最坏的理解：你这不是金葡么，你这不是两份跟随金葡的硫乙醇酸盐流体培养基么？你金葡的阳性对照做两组两个温度！！！——我保证第一个喊冤的不是我，“每份培养基接种的 样·品·量”绝对会让领导们心痛的~~

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6.上市抽验样品的最少检验数量

表1《出厂产品最少检验数量》核对过了，未修改。上市抽验是表2，我们这儿适用于进厂物品的无菌抽样量计算。涉及到无菌包材和甘露醇。

500ml规格的液体制剂从6个改成了10个，开的甘露醇瓶数更多了。

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“医疗器具”10版的表2是没有的，我一直按着《GB-T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分 生物学试验方法》的规定鬼混。这下15版明确了，医疗器具 供试品最少检验数量是10，若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。——就是说注射器/胶塞/助力器/无菌针/无菌袋这些结合表3“每支供试品接入每种培养基的最少量是 整·个·器·具”，一次无菌检验量是直接接种法的10+10+1=21了喽。

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7.供试品的最少检验量

最天雷的表3来了，什么培养基种类，什么菌种归属，这个表一出，成本刷的就窜上去了。

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就看与我们产品相关的几列。

供试品装量V≤1ml，全量。——这条没有争议。直接接种法41支，薄膜过滤法60支，生物制品这规格范围的我们没有。

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10版（二部）

1＜V＜5，  半量

5≤V＜20， 2ml

20≤V＜50，5ml

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10版（三部）

1＜V≤5，  半量

5＜V＜20，  2ml

20≤V＜50，10ml

15版

1＜V≤40，半量，但不得少于1ml

这是神坑啊，以10ml装量举例，20支最少检验数量已定，按着10版，这10ml最多可以供给5份培养基（每份培养基索取2ml），就算要使3份集菌器+2份阳性对照也够了；到了15版，10ml只够给两份培养基，非生物制品，抽30支，生物制品，抽40支。

哦，易溶的样品做时倒无所谓，40个，无非是时间长点罢了。若是大规格的凝胶呢？稀释液体积成倍翻上去，我给算算：

20ml凝胶，6mg/ml，需稀释到1mg/ml过滤，30瓶*20ml*6体积稀释液÷3集菌器=1200ml——一张膜不是只允许过滤1000ml的么？死路中。

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要不继续直接接种法？翻去看，忽然觉察了15版这么改的阴谋！

直接接种同理要求半量，又有接种样品体积最多为培养基体积10%的规定，那么20ml规格，直接接种的每种培养基是：20瓶*10ml半量*10倍=2000ml，要配好多培养基呀，于是大家都会倾向于薄膜过滤了是不？那才100ml滤筒。

我服了你们成不？

我用酶去，哼！

窃以为这个规定不一定行得通，我这儿的产品只是黏稠难滤需要稀释而已，其他药品呢？那些抑菌作用强的，好不容易驯化了一个合适的中和剂，你这一规定，样品量加上去，中和剂也跟着加，这方法适用性试验可有的头疼了。

等最终版的定稿。

8.改版定稿后需做的事情

（1）把无菌灌装验证用TSB尽量与无菌检查用TSB归在一个批号，方便管理。

（2）现在开始如果要买改良马丁培养基，切记不可买多了。

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（3）灵敏度检查重做。

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（4）Z产品2ml、2.5ml、3ml，E成品5万（=10ml）、其他效价（如果有的话），E半成品，E稀释液10ml、其他体积（如果有的话），Y原料药，N产品眼科，以上这些，方法适用性试验重做。也别省略什么菌了，我可不想去个药检所提供的报告是补充版的补充版，全体过一遍。

至于N产品的外科，方法学肯定也同上一起做了。可到底是直接接种法还是薄膜过滤法呢？前者的接种量会让培养基泛滥，后者的接种量必定要用酶，等着15版定稿再说。纠结的大规格，万一哪日它大到100ml去了怎办……

2014.5.13

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谢谢分享！！

分析的很透，谢谢了。

楼主辛苦，看下，新药典也快了吧