液相色谱柱常见问题100问（第一期）

2014-03-28 月旭科技
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1. 网上对柱子是否可以反冲一直有争论，那么什么样的柱子可以反冲，什么样的不可以？反冲后是正着用，还是反着用？
答：一般的正相反相柱应该都能反冲，只有两端筛板孔径不对称的柱子不能反冲，不过目前这样的柱子已经比较少见了。反冲是为了把柱头的污染物冲洗掉，反冲后还是正着用比较好，以免柱子的两头都被污染。我们一直提倡的是：正向使用，反向冲洗。
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2. 对于一根常用的C18柱，拿到一根新柱的时候应该怎样进行活化及维护？为什么要这样做？
3 E4 I( i0 t/ _0 x答：新柱活化，实际上是一个平衡的过程，除了用流动相平衡外，有时候还必须用所测样品对新柱进行平衡，特别是测定分子量比较高的多肽，尤其重要。因为分子量高的物质分子，扩散速度慢，平衡所需时间也相应较长。具体平衡方式也很简单，多进几次样品，直到峰面积和保留时间稳定，再进行正式进样测定。
        如果要加快平衡时间，把前面用来平衡的进样样品浓度加大，或者不等洗脱完成，连续进样多针。用待测物对新柱平衡，目的是将硅胶基质填料表面具有非特异性吸附的位点的吸附能力饱和掉。

3. 测定多肽，一般采用什么柱子？流动相是乙腈和水，还有微量的TFA。特别是像类似三肽的短肽，应该怎么选择柱子？
答：分子量不高的多肽一般选用常规C18柱就能测定，也有用离子交换柱、水性C18柱和Hilic亲水作用柱的。
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4. 氨基柱在进酸性样品时，很伤柱子，如使用一段时间后，柱效降低，峰形改变，如何恢复？
* E2 C. \6 C2 o答：氨基柱测酸性样品，应该是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能会使略带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后对于某些类的分析物保留性质有所改变或表现在柱效下降。建议：用5-10倍的柱体积的含0.5-1.0％NH3的乙腈-水(50:50)溶液冲洗该柱（冲洗后当然要再用不含碱的流动相洗去多余氨），之后再进行分析这类酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如0.1％。
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+ v- u* _8 ^! c% G' N( \9 e5. 色谱柱的技术都有哪些？比如封尾等，这些技术在应用时都体现在哪里？
8 @) r! d/ Q. I8 q2 v, Z7 x答：色谱柱技术包括填料技术和装柱技术，填料技术自不待言，填料的好坏对色谱柱分离性能和选择性有决定性影响。装柱技术也没有想象中的这么简单，不同固定相、不同粒径、不同柱管内径和长度，装柱工艺都有所不同，要装出紧密、稳定、均一的柱床，更多是一门艺术，需要经验积累。
        国内和国外相比，我认为色谱柱的差距在于：国内公司以前都不会自己开发填料，一般买国外现成填料装柱，买到的填料质量控制权不在自己手里。另外因为装柱历史短，经验积累少，装柱工艺也没有完全达到国外水平。另外，对色谱柱性能很关键的基础材料-----裸硅胶，国产的还不过关，在纯度、粒径和孔径的均一性方面和国外产品相比，差距很大。
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6. 色谱柱技术的差距在哪里？
) E* l# [' a) U1 `2 W- R! l答：液相色谱柱装填实际上是有一定技巧和程序，可能还有一些运气。一般使用高压匀浆方法装填，也就是能让填料在溶剂内均匀地悬浮。然后用瞬间高压压实，这实际上用到了不同比例的匀浆液体，和合适的压力。压力太大，颗粒破碎，压力太小，塔板数少。同时压力需要稳定，不然分布不均，拖尾严重。同时还有头上平整程度，套上套，就可以用了。

0 O; h, k" W0 a, p- U& i/ M2 Z  k0 d& q7. 柱子在什么情况下可以清洗一下筛板呢？原来也讨论过这个问题，我也拆下来清洗过，但我看到柱前段的污染更甚，于是就用刀片刮了刮，然后把清洗好的筛板安装上去。问题解决了，但使用寿命会不会减少呢？
答：柱头污染了，就取出污染的，再装一些填料。因为加入你刮了些填料，那么微观的塔板数就少了。假入你刮得不多，仅表面，可能就是一些脏物，所以，问题解决。但是今后还会有同样问题，再挂，那么不小心刮，影响柱效。建议还是装一个预柱。

8. 如果柱子取下来放置一段时间，需要做什么保护吗？
答：对于一般的反相柱，也就是洗干净后放到纯甲醇（乙腈）或者是80%左右的甲醇（乙腈）水中，然后用堵头塞紧柱两头，以免保存溶剂挥发，应该不需要做特殊的保护。
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9. 流动相中加入适量的四氢呋喃可以改善峰形的机理是什么？
' W8 F8 @8 E0 ~" M3 }) q答：《高效液相色谱方法及应用》于世林编著的上面说：甲醇为质子给予体、乙腈为质子接受体、四氢呋喃是偶极溶剂，应该除了极性影响，还有另外的影响因素，至于分离机理，还是比较复杂的，不能看成是个万能方法。
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6 j6 y- L6 r" C0 u10. 关于色谱柱的填装问题。我个人认为现在色谱柱的填装一般有3种情况：1.国外生产填料并填装完成成品卖到国内；2.国外生产填料，国内填装销售；3.国内生产填料，国内填装销售。一般情况下，第1种情况卖的最贵，质量也最好！可是我就不明白了：如果是填料的生产很复杂的话，那么填装方面国内也跟不上去吗？为什么换在国内填装就会出现或多或少的一些小问题呢？
2 m- j, y: {5 R9 w/ Q. A5 |# W答：国内填装会出现质量小问题，和国内目前普遍做事没有国外严谨有关吧。如果工艺技术上没有问题，又能制订并切实执行一整套严格的生产质量管理措施，国内填装和国外填装并无区别。

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液相色谱柱柱压升高问题:造成柱压升高的可能原因有很多。一般是由于色谱柱筛板或柱头发生了堵塞，造成流动相阻力加大所引起。当然色谱系统其他部分发生堵塞，也可能表现为柱压（系统压力）升高。所以在发现系统压力升高时，可首先使用两通短接色谱柱观察相同条件下系统本压是否正常，排除压力升高为系统其他部分造成。
1）色谱柱筛板堵塞，这往往是由于流动相没有过滤，或虽已过滤但滤膜孔径过大或滤片损坏，使固体杂质滞留在筛板上造成的。可采用反冲的方法去除堵塞物。对于5 或3.5um填料的色谱柱，建议采用0.45um 膜厚过滤样品，1.8um 填料的色谱柱，请采用0.2um膜厚过滤样品。同样类似堵塞也会发生于排气阀过滤芯、在线过滤器和保护柱，这时建议更换滤芯，在线过滤器内的筛板或保护柱内的柱芯。
2 G$ f- X$ ~, }9 \; I# U' T2）非特异性吸附 当部分组分在柱子上有较强的非特异性吸附，且当前所用的流动相难以将它们洗脱时，强保留组分的累积则会造成阻力增大和压力升高。可使用适当的溶剂冲洗以除去吸附物质。
3）样品的沉淀当样品所用的溶剂与流动相不一致时，样品进入柱中时有可能因溶解度降低而沉淀出来，造成压力升高。此时建议使用对样品有较高溶解度的溶剂冲洗。
- Q  G% f: n+ j6 a: _4）盐晶体的析出使用较高浓度的缓冲液或添加有缓冲液的流动相后，如果冲洗不彻底，缓冲液中的无机盐成分可能会残留在体系之中。它们会因在新流动相体系中溶解度降低而析出，造成流动相阻力加大，压力升高。
: P7 q' |  S+ S5）更换流动相时置换不彻底当改换流动相体系时，不彻底的更换使不同性质、互不相溶的流动相存在一个体系中，也会造成压力升高。可使用混溶的溶剂（异丙醇）彻底冲洗。