检验那回事之（八）--水分测定

论坛蒲友hongwei2000原创。

好久没写了，一直没想好什么专题，个人觉得专题必须是应用广泛的，而且是比较基础的，这样才容易被人所接受。希望这不是收笔之作。

水分测定是药品生产和检验检验中最常应用的一种技术，中国药典附录上把干燥失重给单列出来，因此水分测定法中只规定了两种方法，卡氏法和甲苯法。实际上我们常用的方法有四种：干燥法、卡氏法、甲苯法（蒸馏法）和气相色谱法（使用电导检测器）。由于甲苯法和气相色谱法应用比较少，且操作没有太多的注意事项，所以不作为本章的考虑内容（当然还有一种叫做热重分析法，这种方法更不常用，有兴趣的可以交流一下）。

干燥失重是我们在药品生产和检验中最常用的方法，其中在实验室中最常使用的干燥箱、减压干燥箱和减压干燥器；在生产中最常用的是红外/卤素水分测定仪。

由于干燥失重本身是一种非专属性方法，它既可以检测水分，同时样品中的残留溶剂（简称RS）也会“干扰”水分测定的结果，即简单地说，干燥失重=水分+残留溶剂，所以我在对照品标定的章节中说，一级对照品的含量=色谱纯度-干燥失重-炽灼残渣（也可以将色谱纯度改成100-有关物质），或者一级对照品的含量=色谱纯度-水分-残留溶剂-炽灼残渣。

所以，在欧美，如果产品中没有一、二类溶剂的话，其三类溶剂的检测可以使用干燥失重的方法来测量，当然前提是LOD NMT 0.5%，因为这个限度是三类溶剂的可接受标准，这时不需要区分0.5%的标准是来源于水分还是来源于RS，这只是一项符合性检查。但对于生产企业来说，还是强烈建议采用专属性方法检测RS而不是LOD，毕竟你要对你的产品要有足够的了解（这个内容本应该在残留溶剂章节中讲述，但由于比较冷清所以这一章节没有写完，需要的话以后继续写）。

当然所有东西都有前提，检验也是一样，LOD能代替水分检测的前提就是：1）RS基本无干扰；2）样品比较稳定，不至于干燥过程中发生分解产生挥发性物质；3）样品中水分能够充分挥发出来。前两条好理解，第三条网上也总有人不太明白，给我发帖问。其实也比较简单，很多化合物，本身结构中就可能带有结晶水，例如初中化学就有蓝色的五水合硫酸铜，失去全部结晶水变成无水硫酸铜后，就变成了白色的了。那么大家就知道了，有个结晶水这么个概念，而且结晶水对于同一个化合物（理论上含不同结晶水的化合物就不能叫同一化合物了，但为了好理解，此处仍称之为同一化合物）来说可能还有不同的数量。所谓结晶水，你可以认为是化合物结构中的一部分，所以要想除去它是相对比较困难的，当然这也和化合物本身有关，有的容易些有的难些，甚至有的化合物在不同的温度下呈现不同的结晶水含量，例如五水合硫酸铜失水-温度曲线呈现楼梯状。那么也就是说，一个化合物在测定LOD时，有可能测定的结果只是游离水，也有可能是总水（当然像硫酸铜那样失去部分结晶水在药品检验中是没有意义的），在你研发制定方法时，就需要考虑你到底是要什么样的干燥结果，必要时应使用卡氏水分测定的方法来确定干燥后的水分是什么样的，含结晶水、不含结晶水、还是还部分结晶水，当然简化处理的方法就是不制定LOD标准，而制定卡氏水分标准。

需要注意的是，对于含量测定，LOD有时也是很重要的，从API来说看起来比较简单，分母带个“1-LOD”，这是因为往往API含量测定的标的物就是API本身或无水物，而对于制剂来说就稍显复杂了，前两天有网友给我留言，就不明白到底是怎么回事了。大家知道，很多药品，含量测定的标的物并不是API本身，有些化合物分子中既含有盐（例如盐酸****）又含有结晶水，而制剂标的物可能是含水的、可能是不含水的、还可能是既不含水也不含盐的，而此时对照品在使用时又恰恰要求进行干燥处理，那么你这时就必须要知道，在干燥处理的条件下得到的对照品到底是含还是不含结晶水的，因为这将涉及到含量计算时分子量系数的折算问题，这个折算可能既涉及到水又涉及到盐。当然这可能也说明中国药典或标准中说明得不够详细，印象中在USP中的品种都有明确的两个分子量用于计算的。

那么LOD测定方法的关键因素是什么呢，简单地说就是温度和真空度，对于减压干燥而言，真空度我们是特定的，所以真正的关键因素就是温度，温度与产品的结合就是你最终能够得到的结果。一般来说，对于没有结晶水的化合物，105℃是可以保证游离水的测定的，但对于含结晶水的化合物来说就不好说了，你可以通过TG（热重分析）和/或卡氏水分来确定。

谈到LOD测定，除非方法以外，还要注意所使用的仪器/设备（简单地说，能直接出数据的叫仪器，辅助性的叫设备）必须经过确认，确认的关键就是温度，对于大型的恒温箱来说，需要做温场分布，对于热天平之类的仪器，还要做天平的确认（包括日校，当然由于数据量不是太大，周校/月校也是可以接受的）。需要注意的是，有些设备并不是空气循环加热的，而是采用加热板加热的，这时的温场分布就不能考虑箱的整体了，而只能考虑加热板的一个平面了。

下面说一下卡氏水分测定。

卡氏水分测定的基本原理是，在有二氧化硫和弱碱性化合物存在的情况下，水分子可以与碘分子定量地发生反应，通过测定反应所消耗的碘的量就可以计算出样品中水分的含量了。

那么，构成卡氏滴定就需要有四种试剂：二氧化硫、弱碱、溶剂和碘。弱碱早期使用的是吡啶，由于其有恶臭，所以现在一般使用的主要是咪唑；溶剂最常用的是无水甲醇，可能最主要的原因是甲醇成本较低，且对大多数有机化合物具有较好的溶解性，因此被广泛应用，但其在有些情况下也有缺点而不能使用，这我将会在后面进行描述；而根据碘的来源不同，卡氏滴定又可以分为两种，一种是容量法，用于测定常量水分（一般认为5mg以上的含水量），此时碘的来源是将碘配制成滴定液，采用直接滴定的方法测定水分的含量；另一种是库仑法，库仑法是没有碘滴定液的，碘分子是通过将电解碘化钾产生的，在测定水分时，当电解液中有水存在时，电极可能检测到电位差，进而产生电流，将碘离子电解成碘分子，用于与水发生化学反应，当水被消耗光时，不再产生电流，也就没有碘分子生成了，仪器通过测定所消耗电量来计算样品中的含水量的，库仑法被认为是微量水分测定方法（一般认为5mg以下的含水量）。

在USP中，卡氏水分测定被列入到<921>中，其中容量法是Ia，库仑法是Ic，在早期的版本中，Ic一节中试剂一项中写的是见Ia。我在08还是09年曾经给USP写过一封信，明确指出这是错误的，虽然没有得到回复，但之后的版本Ic这一章节就被修订了。

下面介绍一下，卡氏水分滴定所要注意的事项：

1、  对于容量滴定来说，由于滴定液是有机溶剂，存在易挥发和易吸水的情况，因此每次使用时应临用新标，包括更换新的一瓶滴定液时，要将整个管路进行润洗后再重新标定。当然，为了节省滴定液，你可以将开始一部分不外之后将管路末端插入滴定液瓶中打循环（当然不建议这样做，毕竟这可能会对检测结果带来风险）。库仑法不需要标定，因为它没有滴定液，但应定期进行确认。

2、  空白干扰。虽然滴定要求是在密闭的容器内进行的，但这种密闭性不是绝对的，即使在环境条件比较稳定的情况下，仍会有水分透过密闭系统进入滴定体系中。这时就要求我们在滴定时扣除这种“空白”带来的干扰。具体操作就是，在滴定系统平衡后，测定一段时间的漂移值，用以计算每分钟平均带来的干扰，再在样品滴定时计算进去（水分量减去平均每分钟漂移值与滴定时间的积）。要注意的是，由于样品在溶剂中溶解需要一定的时间，而这个时间对于有的样品来说甚至比滴定还慢，所以建议你的滴定方法中将样品溶解时间设定在滴定之前，换句话说，你设定一个混合时间（例如1分钟或2分钟，根据样品的溶解性来确定），再进行滴定，以确保滴定结果的重复性和准确性。另外，对于滴定终点的设定也是一个重要的内容，有时药物可能会存在一些反应较慢的副反应（较慢的方法就不适合了，下面会提到）造成滴定后期漂移值较高降不下来，这时你就要考虑设置一个较高漂移值的终止参数或较短的终止时间了，否则可能会造成检测结果偏高，当然其他的方法后面我也会提到。

3、  确认与标定：在实践中，大家往往使用纯化水进行滴定液的标定，但使用纯化水标定有一个缺陷，就是称样量太小（一般为10-20mg），而使用十万分之一天平往往达不到USP最小称量的要求（国内即使能达到误差也可能比较大）。实际上，国际上通用的水标准物除了纯化水以外还有两种，一种是市售的标准水（你自己也可以配制，标定和稳定性研究后自己使用，如同工作对照品，但要密封保存，开封后当次使用），例如1mg/ml，这时你标定时甚至可以使用移液管去定量移取；另一种是二水合酒石酸钠，你可以买带证书的水标定专用试剂，这种试剂水含量好像是15.66%，这样就可以加大称样量以满足天平的要求，但这种试剂有个缺点，就是在甲醇中的溶解性较低，所以在仪器确认时要注意经常更换溶剂。另外，前面说过由于库仑法不需要进行标定，所以在使用时要经常使用标准水对仪器的准确性进行确认（使用不多的可以考虑每月/季确认一次）。仪器确认时要考虑准确性、精密度和线性，尤其是要考虑最小含水量的准确性，必要时可以考虑检测时降低滴定液的浓度。

4、  缓冲体系：由于反应要求是在一个弱碱性条件下进行，较大量的强酸或强碱性药物可能都会影响滴定的进行，因素对于这类药物如采用卡氏水分测定，在方法建立时必考虑在溶剂体系中加入相应的缓冲剂以对抗药物本身对检测的影响。当然还有另外的方法将在下面说明。

5、  副反应：这是卡氏水分滴定的重关键的一环，简单地说，就是：1）凡是与碘可能发生化学反应的，包括氧化还原或络合，典型的如一些强还原剂；2）凡是与溶剂发生反应生成水的。第一种情况，包括上面据说的其他解决方案，就是将水分仪与小烘箱相连，烘箱加热所产生的水和溶剂通过导管转移到滴定杯中进行滴定。对于第二种情况，最典型的就是醛酮化合物，由于它可以与醇发生缩合反应而脱水，进而导致检测结果偏高。这种情况，一般来说解决的方案是使用醛酮专用滴定液和溶剂，最主要的是更换掉溶剂中的甲醇，当然它的缺点之一就是溶解性下降和成本提高。

当然我过去以往的经历还遇到过将样品溶解后转移至滴定杯中测定水分含量（USP Ic早期的方法），结果由于样品的水分含量较低，而空白溶剂本身的总含水量可能要大于样品，所以会造成检测结果误差较大，这我在那次投诉中也有提到，当然现在的USP Ic法好像没有要求必须先溶解后再取样测定了。

至于说市售什么单组分、双组分等，不外就是二氧化硫加在哪里，这里就不再多说了。

还有就是一个小技巧，如果你们当地湿度比较高或者溶剂保存不好时，会造成溶剂含水量较高，这时仪器预滴定可能会消耗较大量的滴定液，你可以事先准备点碘或碘甲醇溶液，如溶剂含水量较高时可以在滴定杯中加一些，要注意不要加多，以节省滴定液的消耗量，当然如果加多了，可以再加一些水，就跟和面一样J。

的确是好文章

细节决定成败