【新技术】最新型一次性生物反应器袋子的泄漏测试

【新技术】最新型一次性生物反应器袋子的泄漏测试2014-08-13 蒲公英

一次性使用技术如今已被广泛接受和使用，特别是一次性使用袋子已被广泛的应用于生物工艺上下游的各个工艺环节。尽管制造供应商的质量保证体系确保了一次性使用袋子出厂时的零泄露，但是如何解决因运输、安装或其它错误操作所造成的风险呢？当然，操作员培训与执行合适的标准操作程序（SOPs）是一种可行的必须的方式，但是它们是降低风险的唯一方法吗？此外，更多公司都在倡导将“舞厅概念”应用于生物制药药物原材料与终产品的生产制造上。然而，你该如何证明所使用的单元操作是密闭的，而且中间工艺环节不会遭受交叉污染的风险呢？

  细胞生长所需的昂贵培养基与典型细胞培养工艺的长持续时间都促使着我们不得不在建立批次时详细严密的审查一次性生物反应袋的密闭性。一个泄露的生物反应器将会导致重大的经济损失，并且会破坏遵循良好生产规范(GMP)的工厂内对时间有着周密安排的生产计划。在疫苗生产工艺中，这样的泄露还可能直接威胁到操作员以及周围环境的安全性，因此无论如何都必须要寻找一种实际可行的方法来规避这种情况的发生。
   安装后使用前的测试有助于降低风险
根据法规指南及可行性指导方针，除菌级过滤器和一次性使用袋子的完整性测试有着明显的区别。根据现行欧盟GMP法规（国际指南中最严格的法规），除菌级过滤器应在灭菌后使用前进行完整性测试，同时还应在使用后立即进行测试。一次性使用袋子没有相关的法规要求，尽管如此，整个一次性使用生物反应器系统（包括管道）仍然有必要在安装后使用前进行袋子的泄漏测试，这样能够检测出典型的可能由操作人员手动失误造成的泄露，极大改善一次性使用生产设备的风险转移能力，同时也能增强操作人员的安全性，提升产品性能的稳定与生物药品交付上市的及时性，从而保障经济和投资的安全性。以一个典型的潜在风险的实际情况为例：在生物反应器的组装过程中和培养基配制时，还有接种液的转移过程中将不同的管道元件进行了错误的连接。这些关键操作中操作员的一个错误就可能导致泄漏，随之可能潜在地发生污染，从而导致一个批次的报废。
   不同测试方法之比较

曾有40多种不同的基于大量技术的测试方法被尝试用于泄漏检测（如，根据EN1779条“泄漏测试：方法和技术选择的标准”），比如气体泄漏检测（完整检测或探测）、热成像、流量测定、压力衰减以及压力增加等。

每项技术在如下方面都拥有自己的优势和弱势：

·精确度和可重复性

·停留时间

·操作方面因素

·测试后袋子情况

·与袋子连在一起进行测试的可能性

·设备的投资成本

·每次测试的费用

·测试设备的占地空间

·与测试本身相关的污染风险

·防尘防溅级别

·原位测试（使用位置）的可行性

在为一次性使用生物反应器开发一个合适的袋子测试设备时，上述因素必须要进行仔细考虑与平衡，使之能很好地应用于疫苗、单抗和重组蛋白的GMP生产。

具备用于安装后使用前测试资质的方法极少

  当一次性使用生物反应器安装于夹持器时，存在一个潜在的操作失误风险。因此若想可靠地为这些袋子完成泄露测试，必须要在所使用的位置进行（使用前安装后）。如果在一个单独的设备里测试一次性使用生物反应器袋子（正如进行气体泄露检测时所常用的方法），然后再将其安装至袋子夹持器，这样依然无法检测出操作员手动错误所导致的泄露，而只能是对于潜在的运输破坏进行弥补性检测。另外，气体泄露检测技术不仅复杂，而且具有一定的成本，因此将之作为一个例行的测试方法显得不够现实。实际上，合适的完整包装（制造商负责）和纸板箱的检查（客户负责）即可发现运输造成的破坏。

质量或体积流量测量是一项普及的技术，但它需要在整个测试过程中都具备一个非常精确的压力控制。初始测试压力只要发生轻微的上升或下降，便会直接影响所测量的流量，并导致测试值的错误估算。体积越大，精确调节压力的难度也越大。因此该项技术不适用于大体积测试。

从另一角度来看，压力衰减技术是一项稳固、易于实施、经济并且已获验证的技术，可用于测试直接安装于固定夹持器的一次性使用生物反应器袋子。因此我们使用这种方法开发出了一个既可靠又可预测泄漏从而降低风险的工具。

开发一个可靠并可重复的方法

任何测试方法的目标都必须是能够可靠地证明所安装的生物反应器袋子的罩袋密封圈、端口焊接、连接以及所有袋子表面的潜在泄漏风险。任何泄漏风险都可能导致生物反应器内部物质的损失，或引发生物安全威胁。在早期基于压力衰减的一个方法的开发过程中，我们证明了当挤压光滑、坚硬的塑料袋表面时，其泄露情况能够完全被掩盖。极少的测试气体可从泄露处跑出，导致压力衰减检测的可靠性为零。因此，对安装于夹持器上的袋子，或者甚至在没有任何多孔垫片将袋子与平板表面隔离开的情况下，对两块支撑板之间随意放置的袋子进行压力衰减或流量测定，都将无法代表一个可靠的测试安装方式，就是由于存在着掩盖效应。

采用一种特殊设计并且具有专利保护的聚乙烯绒布作为生物反应器塑料薄膜和夹持器之间的多孔隔离层可防止掩盖效应的产生（图1）。与用相同的测试方法在非硬表面袋子区域所获得的结果相比，采用多孔隔离层提供了可靠、可重复的测试数据。

压力衰减测试方法

完善的压力衰减测试方法所依据的是来自于美国材料试验协会ASTM F2095-01(3)的方案。来自赛多利斯斯泰迪生物技术有限公司的Sartocheck 4 plus袋子测试仪，与上述可防止因安装而潜在引入的泄露掩盖的袋子测试仪绒布联合使用，可以确保一次性使用生物反应器袋子在其最终的袋子夹持器内，于安装后使用前的使用点所完成的泄露测试，该方法的测试结果安全可靠。

压力衰减测量值对温度的变化非常敏感。因此，Sartocheck4 plus袋子测试仪还提供一支环境温度测量计，如果在测试阶段温度变化过大，则会产生一个警告信号。

目前为止，这个压力衰减方法用于泄露测试的应用技术已被拓展为可靠地检测50L至1000L全线的BIOSTATSTR一次性使用生物反应器袋子的泄漏风险。此方法针对2000L规模袋子的资质证明仍在进行之中。未来还将可以测试一次性使用的2D/3D储液袋。
; [$ F% R5 P$ ~( M; k   由于袋子是在安装之后进行测

试，因此潜在的泄露可在袋子膜壁、密封圈、整个灵活袋子系统的连接点、以及管道处进行检测。测试方法是非破坏性的，在生物制品生产设备使用中完全可以实现可靠并且可重复的使用点泄漏测试（图2）。实际测试时压力衰减测得值需要与方法确认和验证时相关联的标准值进行比较后，才能得出最终是否通过泄漏测试的结果

初始研究建立已确认和验证的标准限值

验证方法由两部分组成：

l  工程研究，以确定不同袋子体积的检测限

l  正式的资质确认，以证明最小的可检测裂缝尺寸，并为测试确定验收标准

为确定最小的可检测裂缝尺寸，采用一个简化配置的袋子，该袋子只有一个底部端口连接用于测试气体进出，同时具有多处“缺陷补丁”代表不同的明确的裂缝尺寸。一个缺陷补丁就是一块带有激光钻孔并且经过流量校准的裂缝的圆形膜片，焊接于袋子表面。为了对已知的裂缝尺寸进行可靠检测，在已知裂缝尺寸的袋子与无缺陷袋子之间必须有显著的压力衰减差。通过大量重复测试，计算出用于不同裂缝尺寸和无缺陷袋子的测试值的标准偏差。最小可检测的裂缝尺寸定义为：裂缝尺寸的最低的压力衰减值至少有六次高于无裂缝袋子的最高压力衰减值的标准偏差。

图3显示了一个200L袋子体积的不同检测补丁尺寸的测试结果。为一个50μm缺陷补丁所测量的压力衰减值与一个无泄漏袋子所测结果一致。因此，一个50μm的裂缝无法可靠地与无泄漏袋子区分开来。相反，100μm的裂缝尺寸则显示出与无泄漏袋子明显的区别。

第二步中，一个标准的无缺陷补丁的袋子和一个标准的带有一个预先确定最小可检测裂缝尺寸的缺陷补丁的袋子被共同用于建立最终的测试参数。
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方法验证确认泄露测试结果的可靠性

在最终资质研究过程中，不同袋子体

积的最小可检测裂缝尺寸通过测试具有统计显著性数量的由不同日常生产批次中抽取的标准袋子所确定。所使用的分别为标准的、非改良的不同体积的袋子，和标准的、改良的具有一个缺陷补丁以代表最小可检测裂缝尺寸的袋子。所有袋子均经伽马射线照射。每个袋子至少经过10组重复测试。表3总结了资质研究过程中无缺陷袋子所测得的最大压力衰减值。

所有测试袋子均显示了预期的结果：无缺陷标准袋子通过了测试，而具有一个预备缺陷的标准袋子测试失败。因此，使用压力衰减法结合绒布的泄漏测试方法经成功验证能够防止裂缝的掩盖，亦被证实为一种具有可预测性的稳定可靠的方法，可用于日常操作中的泄漏检测。
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日常使用中快速有效的袋子泄漏测试方法

新型的一次性使用生物反应袋泄漏测试方法是一种基于压力衰减原理基础上、结合一种特殊设计的多孔绒布，且经验证的测试方法，可用于一次性使用袋子安装后使用前的可靠且有效的泄漏测试。使用此种新颖的测试方法，一次性使用生物反应器可获得同等级别的风险控制以及操作程序的保障。

压力衰减方法在日常操作中也比较容易实施。自动化测试程序和用户指南大大降低了操作员手动失误的风险。在整个测试过程中环境温度的监测则进一步加强了测试结果的准确性和可靠性，同时也防止了测试结果发生错误性合格和错误性不合格的假象，该设备既稳固又经济。节约一个批次的产品，便是快速收回投资回报的一次机会。泄漏测试可有效降低发生生产计划改变和项目延误而造成的风险，尤其是在生物安全性极为关键的生物制品生产工艺（比如：疫苗生产）中，同时这更是保护操作员安全的一个不可或缺的工具。

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