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9 ^: j( P( X% j摘要 :8 x+ |4 F. E$ B2 p1 ] E
液相色谱测定甲醛与2, 4-二硝基苯肼的反应条件, 使反应在菌疫苗类生物制品自身的pH 范围内即弱酸性条件下, 无需酸碱度调节, 反应产物甲醛衍生物不需要有机溶剂萃取, 避免损失, 可直接用于液相色谱分析。在检出限及精确度方面更是优越于分光光度法。结果显示, 该研究方法的色谱条件能准确定量、灵敏、准确、重复性好, 优于药典的分光光度法, 可用于实际检测分析。
目前, 甲醛作为一种防腐剂, 广泛应用在菌疫苗类生物制品生产工艺中, 以防止微生物的污染。游离甲醛含量的检测是生物制品检定的重要指标, 游离甲醛含量的高低关系到制品的质量及人民的生命健康及安全性[1] 。测定生物制品甲醛含量的方法主要采用分光光度法[2] , 本实验探讨了样品反应环境、2, 4-二硝基苯肼衍生体系、色谱条件等。反应产物甲醛衍生物不需要有机溶剂萃取[3] , 在样品本身pH下即弱酸性条件下可直接用于液相色谱分析, 避免萃取过程的损失[4] 和调节酸碱度的繁琐。而且生物制品中实际存在的游离甲醛含量为痕量, 利用萃取法不实际。在检出限及精确度方面更是优越于分光光度法。8 k6 v3 e$ b$ n' n. X2 o6 U
9 m( ?$ [. c0 x9 |+ \3 l. u2 |1 材料与方法: g! z! a! h- y+ c' A1 y# f
1.1 材料1 Y- Y: y' t; d# x6 H
1.1.1 仪器和试剂 安捷伦 HPLC1200液相色谱仪；2、4-二硝基苯肼(分析纯) ; 乙睛(色谱纯) ; 甲醛(分析纯)；冰醋酸(分析纯) ; 氢氧化钠(分析纯)。2 Z, F9 v: G9 q, _+ B" i* `* M
1.1.2 色谱条件 月旭色谱柱: Ultimate XB-C18 柱(4.6×250mm，5um.Part Number 00201-31043 ,Serial Number 211302350) ,流动相: 乙睛:水= 60:40( 体积比) 流速0.8mL/ min,检测波长: 360nm进样量:10uL。
* g8 O& f5 L$ |* E( R* \7 G @( l1. 2 方法
9 h0 l& [$ u! M1 d7 W- o) `1. 2. 1 2、4-二硝基苯肼乙睛溶液(3.0g/L):称取2、4-二硝基苯肼300mg , 用乙睛定容至100mL。缓冲溶液(pH 4.8) : 将32.2mL 1.0mol/L 氢氧化钠和2.8mL冰醋酸加到400mL水中, 并用水定容至500mL。+ M/ O( Z% {" t& F: `4 y* `: z. G; q
1. 2. 2 甲醛标准缓冲溶液的制备 取36%-38% 的甲醛溶液2.8mL, 用水稀释至1L, 碘量法标定甲醛浓度, 用缓冲液将甲醛标准溶液稀释至100ug/mL。临用时分别取100ug/mL 甲醛标准溶液1、2、3、4、5mL, 用缓冲液定容至50mL, 使其分别为2、4、6、8、10ug/mL 甲醛标准缓冲溶液, 待用。. w+ s" ^0 b6 g
1.2.3 样品制备 取吸附白喉破伤风联合疫苗,重组乙型肝炎疫苗适量, 3000r/min 离心10min, 准确移取上清液3mL于10mL 比色管中, 加入0.5mL 2, 4-二硝基苯肼乙睛溶液, 6.5mL乙睛,塞紧塞子, 于60℃水浴20min, 冷却至室温。衍生液经0.45um 微孔滤膜过滤后待测。4 S2 t4 y7 i8 M- \+ ^6 O; S
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2结果% }% a4 R' ^. L8 F+ Z
2.1 检测波长的选择取2, 4-二硝基苯(甲醛) 标准溶液在紫外分光光度计上扫描, 结果表明2, 4-二硝基苯腙在360nm 处有较强吸收。# h& G; M. N0 H3 i) U& g& F! n* V
2.2 流动相的选择
. p' p2 V# i# N# e: s7 d曾尝试比较了甲醇-水和乙腈-水两种流动相体系, 后者优于前者。由于甲醇中含有微量甲醛，本方法选用乙腈。改变流动相中乙腈比例, 对甲醛苯腙的峰面积影响不大, 对保留值影响较大,随着流动相中乙腈浓度增加, 甲醛苯腙的保留时间呈变小趋势。综合灵敏度和分离度两项指标, 选择流动相最佳配比为乙腈:水=60:40(体积比) 。
0 X( H9 j; U" }: J) o2.3 衍生介质乙腈比率的选择
+ f3 P! t6 A" x8 N" G( z* |当乙睛比率达30%-70%时, 在60-300ng范围内, 吸光度随浓度的增加而增加, 有较高的灵敏度和良好线性, 故选定乙腈比率为65% 。8 w$ X. ]7 f! y" e* l6 B4 W
2.4 衍生介质pH的分析
; q4 y/ z6 ]+ E# {+ X0 L, \+ H) g由于本实验样品的pH为5.2-7.2, 曾尝试用pH 3.0- 7.0 的缓冲溶液配制甲醛标准缓冲液, 结果表明在pH 4.0- 6.0 时, 在样品衍生处理时无须加入缓冲溶液调节, 便可提供相同的衍生环境。衍生后测得衍生液的pH值相同。有较高和稳定的灵敏度。简便了实验操作。故选择pH为4.9的缓冲液。
& E; D) ^! J1 P2 D# U* G8 O2 _2.5 衍生温度和时间的确定将甲醛标准溶液按样品方法处理, 分别实验了40、50、60℃ 反应时间对2, 4-二硝基苯腙峰面积的影响。提高反应温度可以缩短反应时间。在60℃加热22min 即可达到反应平衡, 继续加热峰面积仍无明显变化。考虑到生物制品中游离甲醛的浓度和衍生产物的浓度的关系, 故选择60℃加热22min。% E1 }! k' R: @# m8 [4 y% \* s# X
2.6 衍生剂用量
$ K& j! s6 N, u衍生剂2、4-二硝基苯肼的浓度不宜过大, 过大会增加色谱柱的负荷, 并易在柱中形成结晶而阻塞柱子; 浓度过小又不能使甲醛完全衍生[5] 。因此苯肼的浓度应控制在一定范围内, 经实验发现, 3.0g/L的DNPH为宜。综合考虑试剂取样量及实验准确度, 在本试验中应加入3.0g/L的2, 4-二硝基苯肼乙睛溶液0.5mL。
. B% I. o# J' i9 F; n# t1 a0 p2.7线性范围" n5 K k# b) u: W: D. M# q
甲醛浓度分别为0、2、4、6、8、10􀀁ug/mL 的标准溶液, 按上述条件经衍生化后进行测定, 以浓度C(ug/mL) 对峰面积A回归, 线性范围为0.6-3.0ug/mL, 绘制工作曲线, 回归方程为C= 1.818×10-6A+0.159,r= 0.99986 外标法定量。色谱图见图1。
图1 标准溶液和样品的甲醛衍生物的HPLC色谱图
5 { V) Q7 }3 ?5 j6 {2.8方法精确度和回收率
, O/ ]$ s% g0 t& H5 a! w. @ M8 d将重组乙型肝炎疫苗3 批, 吸附白喉破伤风联合疫苗2批, 按上述方法处理后上机测定, 再分别准确移取4ug/mL 甲醛标准溶液2mL, 加入上述样品中, 按样品处理方法操作测定, 结果其回收率为92.4%-98.1%, 见表1。
* P |; a8 m) h0 x* `表1 样品加标回收率和精密度
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2.9样品衍生后的稳定性及干扰实验
样品与2,4-DNPH生成腙是醛类的特异反应, 其他化合物在色谱条件下均无干扰[5,6] ; 按照样品制备项下方法, 对同一样品溶液在8h内每隔1h 进行测定, 甲醛衍生物的峰面积无明显变化,RSD=1.5%(n=8) 。
2.10空白值探讨
实验中发现试剂的空白值较高, 主要来源于DNPH, DNPH 常含有微量甲醛-二硝基苯腙[6] ;乙腈的纯度也有一定影响; 实验中还应该避免使用塑料制品。
2.11方法间比较
将重组乙型肝炎疫苗, 吸附白喉破伤风联合疫苗各3批, 分别用高效液相色谱仪和药典的分光光度法测定, 两种方法的结果均符合药典要求。
. E8 p; f# _0 _% j2 x3 c' E+ ~/ ^3讨论
" ` I7 p. n/ H6 d5 K生物制品中游离甲醛的含量很低, 应用药典的分光光度法, 对于实际样品中存在的游离甲醛含量不能提供准确数据及准确定量, 不能及时反馈生物制品的具体内部信息。高效液相色谱法可提供精确数据, 能及时监控制品质量。
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