有关物质分析方法验证可接受标准的讨论

20060208
栏目	化药药物评价>>化药质量控制
标题	有关物质分析方法验证的可接受标准简介
作者	黄晓龙
部门
正文内容	黄晓龙 　　摘要：本文介绍了在对有关物质检查所用的分析方法进行方法学验证时，各项指标的可接受标准，以利于判断该分析方法的可行性。   t: ~, b/ E  \4 K' X% |0 I4 I　　关键词：有关物质检查 分析方法验证 可接收标准 % g$ k. E! R2 h$ k5 Z) B: v 　　药品中的有关物质泛指在药品的生产与储存过程中产生的工艺杂质或降解产物。由于这些有关物质的存在会影响到药品的纯度，进而可能会产生毒副作用，所以有关物质的控制是药品研发的一个重要方面，也是我们在药品审评中一直重点关注的要点之一。而要对有关物质进行严格的控制，就离不开专属性强、灵敏度高的分析方法，这就涉及到分析方法的筛选与验证。从现有的申报资料看，药品研发单位已基本上意识到分析方法验证的重要性，但是对验证时各具体指标是否可行尚没有一个明确的可接受标准，从而难以对验证结果进行评判。为解决这一问题，本文结合国外一些大型药品研发企业在此方面的要求，提出了在对有关物质检查方法进行验证时的可接受标准，供国内的药品研发单位在进行研究时参考。 　　1．准确度 　　该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求根据有关物质的定量限与质量标准中该杂质的限度分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限度为0.2%，则可分别配制该杂质浓度为0.1％、0.2％和0.3％的杂质溶液），分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。 5 |) C! \1 Z. j6 {# \0 y5 {该项目的可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。 　　2．线性 6 L$ g& b3 C# `　　线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为： 在定量限至一定的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。 可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。 　　3．精密度 　　1）重复性 2 c/ v# M5 T2 K. z' q' r3 I# a　　配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。 　　2）中间精密度 ! X7 m5 w2 V" B* x# \) u  N　　配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于20%。 + D. J( ?+ W$ F6 r6 K　　4．专属性 ) x6 Q% m# o/ ]( e, S　　可接受的标准为：空白对照应无干扰，该杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于2.0。 2 @" H! R# ~; e  B- d+ R+ y' n　　5．检测限 . m! k, a' J5 u9 n　　杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。 9 u. v7 K, Z6 v( m% R, c2 a　　6．定量限 　　杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0%。 9 u# x6 F! M( Q$ s7 x4 M. a　　7．耐用性 ) E- r8 m, F# a- X　　分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、检测波长变化±5nm、流速相对值变化±20％以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：各杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%，杂质含量的绝对值在±0.1％以内。 　　8、系统适应性 　　配制6份相同浓度的杂质溶液进行分析，该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%，保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另外，杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，理论塔板数应符合质量标准的规定。   j2 q; W; f4 I　　9．溶液稳定性 . _# |- `) Y! s. l1 M: `- b& h　　按照分析方法分别配置对照品溶液与供试品溶液，平行测定两次主成分与杂质的含量，然后将上述溶液分别贮存在室温与冰箱冷藏室（4℃）中，在1、2、3、5和7天时分别平行测定两次主成分与杂质的含量。 　　可接受的标准为：主成分的含量变化的绝对值应不大于2.0%，杂质含量的绝对值在±0.1％以内，并不得出现新的大于报告限度的杂质。

! p, k4 ?! U, k2 }; j2 ]现在有必要对有关物质外标法的分析方法验证进行一个讨论，问题如下：
1.系统适用性
9 P6 T; g" X- i   系统适用性主要的内容有：配制相同浓度的杂质溶液进行分析，主要看分离度，杂质峰峰面积的重复性，理论塔板数，拖尾因子，这里面最重要的是分离度和重复性。而我们药典里面之前规定了很多的理论塔板数，2010年药典已经有很大改进，即增加了分离度的要求，或拖尾因子的要求。分离度一般需要大于1.5，拖尾因子用峰面积计算含量一般不大于2.0,但是保留时间的RSD应不大于1.0%难度较大，特别是采集时间较长的分析方法，对于同一天测定的注意柱温，色谱柱和流动相，应该可以达到。
    系统适用性用什么溶液做？一般是添加了杂质对照品的供试品溶液，加入的量多少合适？要看杂质拟规定的限度，可以配制成杂质限度的200%或以下，或与供试品浓度相同。
$ |3 c; R- ^( p7 [) d' l    系统适用性也是方法开发的主要内容，除了用已知杂质进行系统适用性试验外，对于酸，碱，高温，光照，氧化破坏的样品也需要一起评估（专属性）。
, x3 H6 ^% O6 j6 i: c# G* a2.专属性
, j8 H# Q# T3 T    是杂质分析方法开发的重点，需要与系统适用性一起进行评估。破坏5%-10%为宜。
3.已知杂质的检测限和定量限
- A0 M6 |$ n& R这个是需要先做的内容，检测限是检出能力的根本保证，可以根据检测限对供试品浓度和进样量进行调整。定量限是已知杂质的线性起点，需要重点关注。
4.已知杂质的线性
    定量限已知的情况下，拟定杂质控制限度已知的条件下，可以设定线性的点。
5.精密度中的重复性
( C7 X9 P; y; B/ g    电子刊物中讲到“所得6份供试品含量的相对标准差应不得大于15%”，这个15%是针对0.1%杂质浓度而言，不能一概而论。一般杂质超过0.5%的，RSD应小于5%，超过1.0%的，RSD应小于3%。

请大家参与讨论！
5 @: f% ~: w% Y3 w. y7 r

有的有官方，有的没有，文献上有报道，大家对这个问题都比较熟悉了，我这里就不再啰嗦了。

个人感觉ICHQ2A和Q6A说的比较明白了吧

欢迎讨论，我这是抛砖

弱弱问下，你这是你们自己定的标准要求吗？有没官方框架？

顶一下，楼主辛苦了，谢谢分享，期待更多这方面的帖子，好主题

我也对有关物质方法学验证的标准要求有很多不明白的地方，学习了

作为中国官方药物审评机构的专业文献，对于我们的研发肯定是起到一个指导作用的，相信在发表这份文献前，CDE内部一定是经过了详细讨论，并且统一了观点后再发表的，所以个人以为这对这篇文献的讨论是不合适的。当然，以上纯属个人观点，欢迎大家批评指正。

限度控制是0.2%，测试浓度一般配置0.1%，如果配成0.2%不知道是不是可行

你是说重复性或者中间精密度的配样浓度吗？限度控制0.2%，你可能做了50-150%的线性，原则上是可行的，但是这样做的人应该不多。
) C) b+ Z$ n& P( p1 y) Y首先0.1%可能更接近样品的真实值，再者就是你配成0.2%可能会超过限度，造成说明的麻烦。