检验那回事之（七）--有关物质 - 药群论坛

　　原料药中的杂质包括有机杂质（工艺和药物相关的）、无机杂质和残留溶剂。其中有机杂质就是一般我们所指的有关物质，是指在药物生产过程/贮存中所引入/生成的起始物料、中间体、副产物、异构体、降解物、催化剂等1；药物制剂的有关物质主要是指药物自身的降解物以及药物与辅料或包装材料相容性产物等2。有关物质可能会具有不确定的毒性，甚至潜在的致癌、致畸、致突变等性质，因此需严格控制。

　　国内外药典中很多品种有关物质检测方法通过峰面积比较的方法来确定是否符合规定，这种方法忽略了供试品溶液和对照品溶液的实际浓度，是一种限量检测的方法。但这种限量方法有相当的局限性：一是忽略了实际浓度会导致测定数据的准确性降低，二是无法统计出有关物质的稳定性变化趋势和样品的批间差异。越来越明显的趋势表明，国外更多的品种正以定量的检验方法来代替限量的检验方法，本文的目的就是以定量的方法来说明有关物质检验方法的建立、验证和检验的要求。

　　由于药物和有关物质本身一般都是有机物，且具有相类似的化学结构，因此具有专属性（稳定性指示性）和准确性高的HPLC法就作为了有关物质检验的首选方法。本文将针对HPLC法检验有关物质方法的建立、验证和检验与大家作一个探讨。

　　首先需要说明的是，任何一种检验方法都不可能是万能的，HPLC法也是一样，一般有两个大的缺陷：一是HPLC检验的图谱不是一个“全谱”，也就是说一个HPLC方法并不会像TLC方法一样把所有的杂质都会同时检验出来，尤其是国内现在使用较多的恒流的色谱方法，极性相差较大的化合物很难在一个色谱条件下检出；二是有一些杂质在检验条件下没有响应，例如一些化合物的原料/中间体/副产物没有紫外吸收，使用紫外检验器是无法检验到的。因此在建立有关物质的检验方法时，往往需要针对不同的已知杂质建立特定的检验方法，作为有关物质检验方法的补充，这个方法即可能是HPLC法，也可能是TLC法，甚至可能是紫外法或滴定法等等，需要说明的是，对于此类杂质在总杂质计算中不应被重复计算。

　　有关物质HPLC检验方法在建立时需考虑到在该色谱条件下是否所有潜在的杂质都能被检出、各杂质的响应值是否合适、有关物质与含量之间的质量守衡（Mass Balance，即理论上含量降低多少有关物质就应该增加多少）。

　　很多人在有关物质检验方法建立时参考的是含量测定的方法甚至是血药浓度测定的方法，往往这是不合适的，因为这些方法都是针对主成分的测定方法，它不会去考虑杂质的检出情况和准确性，只需要不干扰主成分的测定即可，而且往往在含量测定的浓度下杂质不能够检出，因此无论是流动相的组成还是检验波长，可能都不适合有关物质的测定。

　　由于制剂有关物质的检验重点是降解物和相容性产物，因此原料药生产工艺杂质（包括原料、中间体、副产物等），如果不是降解物的话，都不是制剂有关物质重点关注的内容，在制剂质量标准中甚至可以不订入2。因此制剂有关物质的检验方法很可能与原料药会有所不同，这时需对原料药中可能存在的工艺杂质进行重新定位，这也是方法建立和专属性验证的一部分。

　　有关物质HPLC检验方法的建立主要有四个关键点：色谱柱的选择、流动相的组成、检验条件的选择、杂质测定的方法。下面我将从这四点出发说明有关物质是如何建立的。

　　根据主成分和杂质的化学性质，选择合适的色谱柱，使其能够尽可能在一个色谱条件下检验所有杂质。在选择时往往极性强化合物选择极性色谱柱、极性弱的化合物选择非极性色谱柱，但由于成本和环保的原因，除极性非常强的化合物外（例如糖），一般我们首选非极性色谱柱（例如C18）。

　　流动相的组成往往取决于色谱柱的选择，在色谱柱选定后，通过调节流动相中各组分的比例、pH值、缓冲盐（包括离子对）的种类/浓度等条件，使主成分和杂质能够分离并在一个条件下检验，必要时应使用梯度。

　　选择合适的检验器是有关物质检验的一个重点，各种类型的检验器都有各自的优缺点。例如紫外检验器的优点是成本低、适用性广、操作简单，缺点是紫检验器为非质量型，各杂质和主成分的响应值可能会差别非常大；而蒸发光散射检验器的优点为它是质量型检验器，各杂质与主成分的响应值比较接近，缺点是价格比较高、非挥发性流动相不能使用、检验结果非线性。

　　作为最通用的紫外检验器，有关物质检验波长的选择非常关键，这一方面决定了是否所有潜在杂质能够检出，同时也决定了检验时是否可以采用主成分对照的方法测定（本文中所说的对照既可指主成分对照品，也可指主成分自身对照）。

　　通常只有校正因子在0.9～1.1时才可以使用主成分对照的方法（国外由于有关物质标准制定得比较严格，所以校正因子在0.8～1.2时仍可以使用主成分对照的方法），校正因子超过此范围的杂质应选择外标法或校正因子的方法测定。

　　校正因子一般是通过同时进行杂质和主成分的线性测定（线性浓度范围通常是从报告阈值或定量限到杂质限度或对照浓度的120%～150%），再用主成分的斜率除以杂质的斜率而得出，在计算时将杂质峰面积与校正因子相乘即可。校正因子的概念与EP中的概念相同，与USP中的相对响应因子互为倒数，因此在使用中一定要注意。

　　根据对药典的理解，相当大多数的研发人员和检验人员认为有关物质检验方法应该是一个限量检验方法，验证可以按照限量的方法进行。但这种理解是不合适的，我从以下几个方面来论述有关物质（最起码是限度超过报告阈值的有关物质）应按定量方式进行验证和检验的：

　　A、对于外标的检验方法例如含量，样品称量要求“精密称定”，以代入浓度进行计算；限量法只需要“称取”一定范围内的样品即可，因为称量结果并不代入计算，也就是说样品的称量范围控制在较小的范围内（不是百分之十），只要在范围内，实际称量值已不影响检测结果。在有关物质检验中，往往要求供试品和对照品称量“精密称定”。

　　E、USP3等国外药典中要求未知杂质的限度为不得过0.1%，ICH Q3A和Q3B也要求超过鉴定阈值（一般为0.10%）的杂质必须鉴定，检验时必须采取先修约后判定，这是限量法所不需要的。

　　综上所述，有关物质检验宜采用定量测定的方法，对应的方案验证也应采用定量的方法（限度低于报告阈值的杂质可采用限量测定/验证），即最少需要进行专属性、准确性、精密度、定量限、线性/范围、耐受性等几方面的验证6，同时需进行系统适用性的考查。下面我从验证的几大模块分别阐述有关物质检验方法的验证要求。

　　对于主成分干扰，需要考查已知杂质和强制降解峰是否与主峰重叠，一般需要采用二极管阵列检验器证明主成分峰的纯度。除了峰纯度外，在强制降解试验中，需要考查质量平衡，即在主成分含量降低约10%～20%情况下，含量降低值与有关物质绝对增加值的偏差不超过5%，否则说明有关物质的检验方法不适用，有些杂质未检出，或者有些杂质的校正因子不准确。

　　对于辅料干扰，需要考查已知杂质/降解物峰与辅料峰能够识别并充分分离，以确保杂质能够完全、准确的检验。这里需要说明的是，“把辅料峰算成杂质峰也是合格的”这种理论是完全不对的，辅料峰是不能被计入杂质峰的，因为杂质是被要求准确、定量的。

　　由于有关物质相对浓度较低，因此对于准确性要求也并不像含量测定要求那样高，但也有其特殊性，即回收率计算方法应与检验方法一致。也就是说，如果检验方法规定为外标法，则回收率计算时应采用外标法；如果检验方法规定为校正因子法，则回收率计算时应采用校正因子法；如果检验方法规定为主成分对照法，则回收率计算时应采用主成分对照法。否则一概采用外标法计算是没有任何意义的！

　　有关物质准确性验证一般采用加样回收法，分别验证报告阈值、限度值和限度值120%～150%三个浓度水平下的回收率。在试验时，分别配制相应的对照溶液、供试品溶液和三个杂质浓度水平的加标供试品溶液，计算时分别测定供试品加标前后特定杂质的量，扣除供试品中含有的杂质的量，计算回收率。

　　由于供试品中的杂质种类、数目和含量，与工艺和批间差异有很大影响，因此对于超过报告阈值的杂质，精密度验证可以通过配制多份平行样品进行测定；而对于供试品中不含/含量低于报告阈值的杂质，可以通过计算不同浓度水平回收率的RSD来得出。

　　按照ICH Q2的要求，定量限和检验限一般有三种测定方法，但在实际HPLC方法中应用最多的是信噪比法，即定量限为信噪比10:1、检验限为信噪比2～3:1时被测物的进样量。但在实际中往往这种测定方式是没有意义的，因为信噪比决定于被测物的峰高和噪音的波动大小，不同的仪器、峰保留时间、仪器状态、流动相配制、甚至室温，都可能会严重影响信噪比的测定结果，甚至可能是不同数量级的差别7，因此定量限/检验限不应只在验证时进行，在检验中同样也需要进行确认，并作为系统适用性试验的一部分，以保证检验结果的准确性。

　　如果说这种定量限/检验限的验证方法不适合，那么怎么样去进行定量限的验证呢？根据ICH Q3A和Q3B的要求，定量限不得高于报告阈值，因此我们通常按照报告阈值相对浓度配制成相应的对照品溶液，在进样检验，要求其信噪比不得低于10:1（对于限量检验，要求按照限度值配制的对照品溶液的信噪比不得低于3:1）。这种溶液同样在有关物质检验中也应当考查，如果信噪比没有通过，则系统适用性试验没有通过，需要通过更换流动相/色谱柱/色谱仪等方法来解决。

　　一般至少五个点，从定量限到限度值的120%～150%，上限不宜过高，否则线性斜率会发生漂移，相关系数至少为0.99，面积归一化法至少为0.999。如果定量限和限度值150%回收率通过，可不必考查Y轴截距与斜率的比值。

　　有关物质一般不宜做较大范围的变化，尤其是梯度的方法，可重点关注相同规格不同品牌的色谱柱之间的耐受性，其他例如流动相比例±2%、pH±0.1、柱温±5℃也需要关注。

　　溶液稳定性也可以作为耐受性的一部分，这里既需要考查供试品溶液的稳定性，也需要考查对照溶液的稳定性。溶液稳定性是检验结果是否有效的基本依据，也会实验室调查提供了可能。对于有光敏感的样品必要时也应考查光稳定性。

　　有关物质检验中最常见的系统适用性试验一般为重复性和分离度考查。重复性一般是通过连续进样对照溶液/系统适用性溶液（一般为五针或六针），计算峰面积的RSD得出的，一般0.1%杂质溶液的RSD不得过10%、0.5%～1.0%杂质溶液的RSD不得过5.0%、1.0%以上杂质溶液的RSD不得过2.0%；由于国外对杂质研究得比较细，往往分离度测定是通过配制专门含有特定杂质的对照品溶液/系统适用性溶液/分离度溶液，再进样检验完成的，而国内由于对杂质研究比较粗，往往是通过观察供试品溶液的图谱来完成的。

　　在一些药典或标准中有这样的描述：“小于对照品溶液主峰面积0.5倍的忽略不计”，这实际上是指杂质的报告阈值，而并不能当作最小峰面积。因为杂质检测是定量测定的，检测结果是通过计算后再修约得到的，如果按照此峰面积设置最小峰面积，则有一部分峰面积略小于设定值的杂质不会被积出，进而造成漏检，例如最小峰面积设定为100，则峰面积为99的杂质不会被积出，但二者的计算结果可能都是0.05%。那么是不是最小峰面积设置得越小甚至是0才好呢？也不是，这样会造成非常小的峰甚至小于检测限的峰也被积出，影响最终的计算。参考EP和最新的USP对于色谱法测定有关物质的要求，最小峰面积一般设置为不超过报告阈值的一半4,5，但在最终结果的报告中，只有超过报告阈值的杂质才被报告和计入总杂质。这也是同一份样品在不同实验室中的检测结果可能存在巨大差别的重要原因。

　　在很多检验中会有主峰与杂质峰不能完全分离的情况，这时积分就非常重要了，一般系统默认的方法都是将相邻峰沿谷底进行垂直分割，这样会造成杂质峰内含有大量的主成分在里面，这时应采用谷-谷积分（或者采用切线积分）4,5的方式进行积分，以保证杂质峰内不包含主成分，而由于主万分浓度远大于杂质，因此也可以确保积分后剩余的三角形中不包含杂质（切线积分下面没有三角形，三角形面积均计入主成分），进而计算出准确的检测结果。

　　但需要注意的是，两个杂质峰没有完全分离的话是不能采用谷-谷积分的，否则下面的三角形面积将被漏检，这时应根据实际情况决定采用垂直积分或者切线积分的方式。

　　采用自身对照法比较简单，直接用供试品溶液杂质峰面积除以对照溶液主峰面积，再除以对照溶液的稀释倍数即可；而对于采用外标法或主成分对照品法时，需要分别计算对照品溶液的浓度和供试品溶液的理论浓度，其中供试品溶液理论浓度的应考虑供试品的含量，尤其对于不稳定的制剂产品。

　　为便于申报数据的统计、稳定性和趋势分析的要求，一般可以将有关物质计算的结果进行修约（用于放行检验的可以按照质量标准的小数点位数进行修约）：对于原辅料结果小于1的应保留至2位小数，对于结果大于1的应保留至1位小数1；对于制剂产品结果小于1的应保留至与报告阈值相同的小数点位数，结果大于1的应保留至1位小数2。

　　将修约之后的结果与报告阈值进行比较，如果结果大于报告阈值，应报告实际修约结果；如果小于报告阈值，则可以报告“小于***（报告阈值/定量限的数值）”。对于一些特定杂质，峰面积小到未被积分时，可以报告“小于***（检测限的数值）”/“未检出（检出限为***）”。

　　有关物质总杂质不应该采用总峰面积，按照单个杂质的计算公式进行计算，因为这样会将小于报告阈值的杂质也同时计算在内，造成结果的不准确。总杂质在计算时，应将所有规定内的各超过报告阈值的杂质相加得出。

　　有关物质在检验时，应尽可能地保证使用相同品牌、填料和规格的色谱柱，甚至相同品牌的仪器和试剂，以保证各杂质峰位置的一致性。在有关物质报告时，应同时报告各杂质的相对保留时间，一般相对保留时间2.0以内的杂质可以确定至小数点后一位，2.0以上的杂质会由于系统的漂移最好规定一定的范围。在稳定性和年度质量回顾时对于有关物质的统计应基于相对保留时间分别对单一杂质和总杂质进行统计。