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生物等效性研究一般选择18~24例健康受试者，采用交叉试验设计，用生物利用度研究的方法，以单次服药后的两种药物AUC、Cmax参数为指标，比较同一种药物的相同或者不同剂型的制剂，在相同的试验条件下，其活性成分吸收程度和速度有无统计学差异，目的是考察制剂的质量和临床应用的可替换性。其统计分析过程是：先对受试者服用受试制剂和参比制剂后的两种药物AUC、Cmax等参数经对数转换，后以方差分析（ANOVA）进行显著性检验，最后用其平均值（应为几何平均值）进行双单侧t检验和计算90%置信区间来评价和判断制剂间的生物等效性。目前我国采用的平均等效性判断标准为：受试制剂与参比制剂AUC平均值之比的90%置信区间应在80%~125%范围，受试制剂与参比制剂Cmax平均值之比的90%置信区间应在75%~133%范围，其中后者较FDA现行的80%~125%标准均更为宽泛。如以对数转换值来表示，则受试制剂与参比制剂lnAUC之差的90%置信区间应在±Ln1.25间；两制剂lnCmax差值的90%置信区间应在±Ln1.33之间。FDA两药代指标的等效限值均为±Ln1.25。: K: P2 Z9 @( E/ z7 G* k. y
当某一药物的个体内变异系数CV（以AUC和Cmax计算的个体内变异系数）大于或等于30%时，称之为高变异型药物（highly variable drug）。对于这类药物，采用上述通常意义的18~24例2×2自身交叉设计和等效性判断标准进行生物等效性评价时，由于个体内差异加大，使得把握度降低，极可能导致犯统计学上的Ⅱ类错误，造成结果是将实际与参比药生物等效的受试制剂判断为不等效。" Y: r: P4 [4 Y$ t' A. }& u
当前，统计学家和一些发达国家的药政管理机构也在积极探讨如何切实有效地解决该问题，FDA专门开过数次专家会和专题会讨论，欧盟EMEA于2006年7月还发布了针对高变异药物生物等效性研究的概念书。目前这些专家和机构提出的解决办法有：增加受试者数量，提高试验的样本量；试验设计采用重复交叉设计或多剂量稳态评价；采用成组序贯研究，使用期中分析方法做统计处理，根据情况适当调整显著性水平，必要时可按追加受试者设计；放宽等效性判断的限值范围等。以下对主要的几种方法作一简要介绍。
1 增加样本量" U) g) i# j( V; w1 C6 w" Y
如表1所示，相同试验设计条件下，两制剂等效性检验中检测指标的变异度越大，则所需受试者例数越多，只有保证足够的样本量方能达到一定的把握度，按照规定的显著性水平，对生物等效性结论作出明确的判断。- ]& Z" J% S( Z- g' I7 `
对于高变异药物，选择通常的18~24例受试者显然不够，以变异度为30%的药物为例，假定两制剂间的评价指标的真实差值为5%，采用两周期、双交叉试验设计进行生物等效性检验时，样本含量至少应为40例，其等效性评价结论才可以达到80%的把握度，欲达到90%的把握度，则需要至少54例。增加样本量是解决高变异药物生物等效性评价最直接有效的方法，但同时也使试验成本大大增加，试验的操作难度增大，并且存在伦理学和试验管理等问题。
表1 平均生物等效性研究中不同变异度的样本含量估计（两制剂的真实差值Δ=0.05）
σWT σD 80% Power 90% Power5 c7 j- A2 \" x# S
2P 4P 2P 4P
0.15 0.01 12 6 16 8
0.10 14 10 18 12
0.15 16 12 22 16
0.23 0.01 24 12 32 16
0.10 26 16 36 20
0.15 30 18 38 247 W9 V; _& g1 M9 S# b3 r$ e; O3 T
0.30 0.01 40 20 54 28
0.10 42 24 56 30
0.15 44 26 60 34
0.50 0.01 108 54 144 72
0.10 110 58 148 76
0.15 112 60 150 80
σWT表示源于个体内变异的变异系数；σD表示源于药物制剂和受试者间交互作用的变异；2P为2周期交叉试验；4P为4周期交叉试验；Power指统计检验的把握度。
2 重复交叉设计和多剂量稳态评价
以两制剂生物等效性评价为例，两周期双交叉试验设计不能提供个体内变异和个体与药物的交互作用信息，可采用如下四周期、重复交叉试验设计：
第一周期 T R3 ~- |! S _( s/ ~9 |* ?2 @( p/ c# R
第二周期 R T" ~6 i9 X! _5 u( n
第三周期 T R
第四周期 R T: O( t' }6 l5 |7 k, {$ H4 U* n+ @
根据表1，对于变异度为30%的药物，如两制剂间的评价指标的真实差值为5%，则采用重复四周期交叉试验设计，选择28~34例健康受试者进行生物等效性评价，即可获得90%的高把握度。
由于多剂量服药达到稳态时，个体内变异度一般不大，故也可采用此法来比较和判断受试制剂和参比制剂的生物等效性。但这些方法由于试验周期的延长同样存在试验成本增加、试验难以管理及受试者易脱落等问题。
3 放宽等效性判断的限值
前述两种方法都存在着试验成本增加、伦理上受试者承担了更多的风险、试验难以管理的缺点，因此探索不增加样本量的方法一直是大家更为关注的目标，放宽等效性判断的限值就是这样实际有效的方法，FDA的有关专家将该方法又分为静态放宽、固定样本量的放宽及比例标化法放宽等几种方式。
3.1 静态的放宽（static expansion） 由于生物等效性的样本量主要取决于个体内变异度最高的检测指标，通常情况下，Cmax采用实测值，且受采样时间和采样频率等因素影响大，故变异较AUC指标为大。药政部门可根据情况硬性制定放宽的认可标准，FDA现行的关于Cmax的等效性判定标准是应在80%~125%范围，对于高变异药物FDA建议将其放宽为75%~133%，甚至70%~143%。而我国目前采用的等效性判断标准，无论是否属于高变异药物，对Cmax实际已采用了较宽范围（75%~133%），对于非高变异药物其实是放松了相应要求，应该说不是十分妥当的。
3.2 固定样本量的放宽（expansion based on fixed sample size） 即选用18~24例健康受试者，将参比制剂自身进行两周期交叉试验设计，以此试验结果得到的90%置信区间为等效性判断标准，采用相同的受试者，进行受试制剂与参比制剂生物等效性评价。该方法的缺点是机械地以不增加样本量为前提，对制剂间差异所显示意义的考虑不够充分，如受试制剂与参比制剂间存在着一定差别（假定这种差别不能导致临床意义的区别，即临床上两种制剂应属等效），则按参比制剂自身比较确定的等效范围标准判定，则极可能受试制剂不符合等效要求。
3.3 比例标化平均生物等效性（scale daverage bioequivalence） 该方法是根据参比制剂的个体内变异，成比例放宽等效性判断的限值，具有更强的科学性和可操作性，也是FDA比较倾向采用的方法。简言之，可假定等效范围限值BElimits（以下以BEL表示）是随参比制剂个体内变异变化而变化的函数，即：
BEL=kσ
通常情况下，个体内变异较小，σ≤σ0时，BEL=BEL0，两制剂如生物等效，有：' a3 t* ^, ]' o/ y w+ w/ L
-BEL0 ≤ (μT-μR) ≤ BEL0，$ `# \- E! F- y; a/ x
k=BEL0/σ0，2 [7 m, W3 [, {" x: y
其中σ是度量药物个体内变异的实测标准差，σ0为事先确定的个体内变异的判断常数。
对高变异药物σ>σ0应该有BEL=(BEL0/σ0)σ，则：
-BEL0/σ0 ≤ (μT-μR)/σ ≤ BEL0/σ0，( P, ]# D, L6 ^' N& j
按现行标准BEL0=ln(1.25)=0.223，故上式可推出: A w% p( S8 c+ N$ o/ t* P
-0.223σ/σ0 ≤ (μT-μR) ≤ 0.223σ/σ0
因此，对于高变异药物，可通过重复交叉试验或部分重复交叉试验，得到参比制剂个体内变异度，然后根据下式计算放宽的新等效判断限值：$ G w& j9 ` O' M( _; G
BE limits，upper，lower = EXP（±0.223σ/σ0）# ^/ i$ d& c: r0 A/ s6 q" Z5 t
其中σ是度量参比制剂lnAUC或lnCmax个体内变异度的个体内标准差，σ0是药政部门确定的常数，当CV=30%时，该常数为0.294。- j3 j3 f" F3 y! A
该方法可在不增加样本量情况下，对高变异药物作等效判断的把握度大大提高，因而可有效地保证高变异药物生物等效性评价的科学性和可靠性，但该法也有缺点，即不能灵敏地区分两制剂的点估计值，也就是即使两制剂间AUC或Cmax平均值的比值的90%置信区间在新等效范围内，但其几何平均值之间却可能差异很大，已达到不可接受的程度。因此FDA建议应用该法放宽等效标准的同时，还应对其平均值数据设定界值范围进行限制，如两平均值之间相差不超过20%等。
在2007年5月FDA和美国药剂家学会（AAPS）合办的“生物等效性，生物药剂分类相关研讨会”上，来自FDA仿制药审评部的Sam H. Haidar博士提出了FDA当前最新的一些建议（尚在评估中），即：对于高变异药物，倾向运用比例标化平均生物等效性研究方法（scaled average bioequivalence），采用三周期部分重复设计，参比制剂重复给药2次，受试制剂给药1次，例如RTR，TRR，RRT顺序，受试者样本量至少需24例，等效范围以公式BE limits，upper，lower = EXP（±0.223σ/σ0）计算，其中σ0取0.25，结果判断是两制剂几何均值之比的90%置信区间需在算得的范围内；此外两制剂的几何均值之比不得小于0.8，也不得大于1.25，即落在[0.80~1.25]区间内，同时满足这两个条件方认为受试制剂和参比制剂生物等效。7 ^ w- A* U# a
总之，高变异药物的生物等效性研究是一个比较复杂的问题，目前尚无专门的指导原则，还需大量试验基础与理论的结合，需要更加深入细致的研究和探讨。本文仅就当前国际上关于高变异药物的生物等效性试验设计和统计分析方法的进展作一简要介绍，希望能够有助于国内临床研究单位加强对高变异药物生物等效性研究问题的重视，从而更加科学可靠地评价高变异药物的生物等效性。
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